- 文献综述
- 引言
世界上第一台显微镜诞生于十七世纪，由列文虎克发明，从此人类进入了原子时代。它把人类从一个仅仅可以用肉眼或者靠手持透镜观察的世界带到了一个可以看到数以百计微小动物和植物及其内部构造的全新的微观世界中去。显微镜根据其工作原理可分为光学显微镜和电子显微镜。相对于光学显微镜，电子显微镜的放大倍数和分辨率有着明显的优势，放大倍数达千万倍以上，分辨率可达纳米级。但是由于其需要在苛刻的环境下工作，价格较高，电子显微镜没有被广泛应用。而光学显微镜以其操作便捷、价格低廉等优势而被广泛应用于日常的观察和科学研究。然而传统的光学显微镜由于受到自身结构和光波特性的影响，其分辨率有限。因此为了进一步观察样品的微观结构，人们逐渐在显微技术中引入荧光染色标记技术，通过增加图像与背景的对比度的方法提高成像的分辨率，这一技术也逐渐成为显微镜的重要辅助手段，并占据重要的地位。双光子荧光显微成像技术是生物成像领域最重要的发明之一，利用该技术可以对生物样品进行非侵入性研究，在三维空间内获得亚微米的成像分辨率。荧光的产生需要同时吸收两个入射光子，这种非线性效应使得双光子显微成像具有高分辨率、高对比度和光漂白只发生在焦点附近区域等优点。另外，使用近红外的飞秒激光作为激励光源，双光子荧光显微成像技术不仅可以减少对生物样品的光损伤，还可以获得超过1000mu;m的成像深度，这也是该技术与共聚焦荧光显微成像技术相比最主要的优势。
- 激光扫描共聚焦显微技术基本原理
长期以来，普通光学显微镜对于我们理解生物显微结构，揭示生命现象发挥了很大作用。然而，由于普通光学显微镜自身的光学结构装置的缺点和光波特性的限制，其分辨率已接近理论极限。因此，人们开始利用通过增加物像与背景的反差来改善成像质量，提高图像清晰度，从而间接得提高显微镜的成像分辨率。在这种巨大的需求的推动下，为达到提高显微镜的成像分辨率的目的，激光共聚焦扫描显微镜就随即产生了。
激光共聚焦扫描显微镜是在普通荧光显微镜基础上，以激光作为光源，利用共轭聚焦系统和激光扫描系统而组成。首先对样品进行荧光探针的标记，选择特定的激光经过显微镜光学系统聚焦到目标样品上，在显微镜物镜聚焦点所在的样品的焦平面处形成微米级光斑，使得该区域的荧光探针分子被激发而产生荧光。荧光通过共聚焦装置在探测针孔处选择后被光电倍增管收集，然后在计算机显示屏上成像。在整个光路中，有几个重要的装置，其一是圆二分色镜，也叫分色镜，分色镜的作用是把样品激发荧光同其它非信号光分开，它具有使短波长的激发光反射而使长波长的发射荧光透射的能力，这样激发荧光就可以透过分色镜由光电倍增管接受。其二是检测针孔，检测针孔位于检测器前面，起到空间滤波器的作用，它的作用有两点，首先，阻挡掉材料聚焦平面以外的被激发出来的散射荧光：其次。阻挡掉材料聚焦平面焦点斑外的散射荧光，这样就使得检测器检测到的荧光全部是样品聚焦光斑区域的荧光，具体光路原理如图2所示。因此，这样就大大提高了显微镜的成像信噪比和清晰度。对于该技术在观察相对较厚的样品时，越发能体现出它的优越性来。对于较厚的材料，我们通过计算机控制的微动马达带动显微镜载物台的上下移动来实现对材料的不同聚焦平面的选择。微动马达带动的显微镜载物台可以通过每次移动0.1微米的距离来移动样品。这样我们把XY平面扫描与Z轴扫描相结合，就可以获得样品的三维图像。
检测针孔是激光共聚焦扫描显微镜光路系统中的核心装置。如图2所示。检测针孔位于检测器前面。起到空间滤波器的作用，只有聚焦平丽衍射光斑在样品中激发而产生的荧光（如直线所示）才能通过检测针孔被椅滑I器收集。而聚焦平面衍射光斑以外的所有激光在样品中激发产生的其他荧光（如虚线所示）则不能通过检测针孔被检测器收集。因此，激光共聚焦扫描显微镜能够对样品内部进行高分辨率的荧光成像的能力正是来源于检测针孔的这种特点。
图1 激光共聚焦扫描显微镜原理图
图2 激光共聚焦扫描显微镜共聚焦光路原理图
从基本原理上讲，激光共聚焦扫描显微镜仍然是一种光学显微镜，但它与普通光镜相比从技术上作了以下几点改进：
- 采用激光做光源
因为激光的单色性非常好，方向性也很好，整个光束的波长相同，因而从根本上消除了色差。
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