棕榈凤头鹦鹉与白凤头鹦鹉肠道微生物的比较研究文献综述

选题名称

棕榈凤头鹦鹉与白凤头鹦鹉肠道微生物的比较研究

研究的目的

及意义

研究目的：研究凤头鹦鹉科属间的生物肠道菌群组成差异、通过肠道菌群与宿主之间的专一性关系判断宿主间演化上的亲缘关系

研究意义：通过对肠道菌群组成与宿主间的专一性关系了解受威胁物种易患的肠道疾病，便于进一步研究有效的肠道疾病治疗方案，这对于受威胁物种的保护有着十分重要的意义。

国内外同类

研究概况

国内：对于肠道菌群与宿主之间关系的研究方面，国内研究者做的绝大多数都是关于哺乳动物的研究，对于哺乳动物肠道菌群的多样性、对宿主生理状态的影响相关方面进行了大量的研究，而关于鸟类肠道菌群的研究几乎没有（仅看到有关雉科鸟类的相关研究）。棕榈凤头鹦鹉和白凤头鹦鹉都是国外物种，国内几乎没有关于它们的研究。

国外：对于肠道菌群与宿主之间关系的研究方面，国外研究者选用的研究对象一般为小鼠，主要研究方向为肠道菌群与宿主肥胖之间的关系，关于胃肠道疾病方面的影响也有一定的研究。对于棕榈凤头鹦鹉与白凤头鹦鹉进行的主要是行为学方面的研究，另外，从基因方面推断其进化历程的研究也有一些。

总结：国内外几乎没有关于凤头鹦鹉科肠道菌群的研究，因此本研究对于确定肠道菌群在凤头鹦鹉科动物体内的分布具有专一性以及对于了解凤头鹦鹉科动物的肠道疾病和保护濒危凤头鹦鹉科物种有着重要的意义。

研究对象与

研究内容

一、研究对象

1、肠道菌群：

肠道菌群是动物肠道的正常微生物，有合成多种宿主生长发育必须的维生素、利用蛋白质残渣合成必需氨基酸并参与糖类和蛋白质的代谢、促进铁、镁、锌等矿物元素的吸收等功能。这些营养物质对人类的健康有着重要作用，一旦缺少会引起多种疾病。

以人为例，人体肠道内寄生着10万亿个细菌，它们能影响体重和消化能力、抵御感染和自体免疫疾病的患病风险，还能控制人体对癌症治疗药物的反应。人体肠道内的微生物中，超过99%都是细菌，存活的数量大约有100兆，500～1000个不同的种类。这些数目庞大的细菌大致可以分为三个大类：有益菌、有害菌和中性菌。

有益菌，是人体健康不可缺少的要素，可以合成各种维生素，参与食物的消化，促进肠道蠕动，抑制致病菌群的生长，分解有害、有毒物质等。

有害菌，数量一旦失控大量生长，就会引发多种疾病，产生致癌物等有害物质或影响免疫系统的功能。

中性菌，即具有双重作用的细菌，在正常情况下对健康有益，一旦增殖失控，或从肠道转移到身体其他部位，就可能引发许多问题。

肠道菌群依据数量多少可以分为优势菌群（predominant microflora)和次要菌群(sub—dominant microflora)。

优势菌群：指肠道菌群中数量大或种群密集度大的细菌，一般在10～10cfu/g以上，包括类杆菌属、优杆菌属、双歧杆菌属、瘤胃球菌属和梭菌属等专性厌氧菌，通常属于原籍菌群。优势菌群是对宿主发挥生理功能的菌群，在很大程度上影响着整个菌群的功能，决定着菌群对宿主的生理病理意义。优势菌群与微生境的特征密切相关。

次要菌群：数量在10～10cfu/g以下，主要为需氧菌或兼性厌氧菌，流动性大，有潜在致病性，大部分属于外籍菌群或过路菌群。乳杆菌在数量上归为次要菌群，在回肠中含量较高，但是其具有较为重要的功能，因此在功能上归属于优势菌群。

肠道菌群在长期的进化过程中，通过个体的适应和自然选择，菌群中不同种类之间，菌群与宿主之间，菌群、宿主与环境之间，始终处于动态平衡状态中，形成一个互相依存，相互制约的系统。

影响肠道菌群的主要因素有4个方面：动物自身的因素以及动物所处的环境因素；动物摄入的饮食；细菌自身因素；细菌之间的相互作用。

在许多动物的肠道菌群中丰度最高的为厚壁菌门以及拟杆菌门。动物肠道菌群的形成受多种因素的影响，其中宿主的系统发生地位以及宿主的食性被认为是影响动物肠道菌群组成的两大影响因素。因此在实验中，对于食物一致性的控制是确定肠道菌群对其宿主专一性、忠实性的关键步骤。

2、棕榈凤头鹦鹉（LC）

棕榈凤头鹦鹉（学名：Probosciger aterrimus）仅1属1种，体长49-68厘米，翼展70-100厘米，体重500-950克。是典型的攀禽，鸟喙强劲有力，喙钩曲，上颌具有可活动关节，喙基部具有腊膜。肌肉质舌厚。脚短，强大，对趾型，两趾向前两趾向后，适合抓握和攀援生活。栖息于热带雨林中，森林边缘地带、开阔稀树的草原地带等。以植物种子及嫩芽为食。通常成对活动，繁殖期聚小群，分布于新几内亚及其周围岛屿和澳大利亚昆士兰约克角半岛北部地区。

繁殖时间取决于气候条件，在澳大利亚，繁殖期约在8-1月，在新几内亚约在8月间。一窝只产1枚卵，偶尔两枚，孵化期约30-33天，羽毛长成约13-16个星期，性成熟的年龄大约为6至7年。

人工繁殖较困难，盗捕现象很严重，种群数量受到威胁。在2012版IUCN红色名录中被列为LC（无危物种）。在最新的2017版中依然是LC级。数量持续减少中。

3、白凤头鹦鹉（EN）

白凤头鹦鹉（学名：Cacatua alba）是鹦形目凤头鹦鹉科凤头鹦鹉属的鸟类，全长约46厘米。是最多产的凤头鹦鹉之一。栖息在海拔600m以下的山丘地森林、开阔林地、森林边缘地带、红树林、沼泽区等地，通常聚小群活动，天然食物包括坚果、种子、浆果、水果等。分布于印度尼西亚摩鹿加省的北摩鹿加群岛。

在1984年时约有12193只野生的白凤头鹦鹉被捕获，出口或走私至别的世界各地，不包括约有7-10%的野生鸟在未被贩卖时即死亡和印尼国内买卖的数量。当地居民有时也猎杀它们作为食物，加上栖息地破坏导致的巢穴不足等问题，使它们的数量不停地下滑，全世界的总数量约在5万至20万只之间，但有可能更多。在2012年IUCN红色名录中曾被列为VU（易危物种），在2017最新版中被列为EN（濒危物种）。数量持续减少中。

4、16S rDNA

16SrRNA为核糖体的RNA的一个亚基，16SrDNA就是编码该亚基的基因。细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码 rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中。

16S rDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌DNA含量的80%），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。在大多数原核生物中rDNA都具有多个拷贝，5S、16S、23S rDNA的拷贝数相同。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。

16S rDNA的序列包含9或10个可变区（variable region）和11个恒定区（constant region）。根据实验目的的不同可以对可变区进行选择性测定，本次实验选择的是v3-v4区段进行测定。保守序列区域反映了生物物种间的亲缘关系，而可变序列区域则能体现物种间的差异。16S rDNA分子的序列特征为不同分类级别的近缘种系统分类奠定了分子生物学基础。目前16SrDNA的序列信息已经广泛应用于菌种鉴定和系统发生学研究。

二、研究内容

1、比较棕榈凤头鹦鹉与白凤头鹦鹉在演化过程中经历的环境差异

2、研究棕榈凤头鹦鹉与白凤头鹦鹉体内的肠道菌群组成状况

2、辨识对宿主具有专一性与忠实性的肠道菌群

4、建立属级与肠道菌群组成特异性的联系，以此来验证肠道菌群的专一性与忠实性

三、研究方法

随着生物技术的飞速发展，传统的微生物鉴定方法常常难以鉴定众多的生长习性复杂的微生物，因而基于基因组序列的分子鉴定受到广泛关注。在细菌基因组中，编码 16S rRNA 的 rDNA 基因具有良好的进化保守性，适宜分析的长度（约为1540bp），以及与进化距离相匹配的良好变异性、高信息量，因此成为细菌分子鉴定的标准标识序列，其RFLP 分析能够较好地反映出属、种和亲缘关系较近的菌株间的差异。

本实验采用16S rDNA测序法，通过PCR技术获得样本中的16S rDNA信息，将其与CICC的基因文库进行比对，从而得到肠道菌群的组成信息（种类、数量、比例）。将两种生物的肠道菌群16S rDNA进行RFLP分析，找到物种特异性的肠道菌群类别，通过各类数据分析与比对，得出结论。

四、数据分析与实验流程

①序列归并和OTU划分

·OTU划分

·OTU分类地位鉴定

·OTU精简和分类鉴定结果统计

·多样本共有OTU的Venn图分析

②Alpha多样性分析

·Rarefaction稀疏曲线

·Specaccum物种累积曲线

·丰度等级曲线

·Alpha多样性指数计算

③分类组成分析

·各分类水平的微生物类群数统计

·各分类水平的分类学组成分析

·Metastats分析

·LEfSe分析

④菌群组成交互式可视化

·系统发育树构建

·MEGAN可视化展示

·GraPhlAn可视化展示

·GraPhlAn可视化展示

·Krona交互式展示

·热图分析

⑤Beta多样性分析

·PCA分析

·UniFrac-PCoA分析

·UniFrac-MDS分析

·UniFrac-UPGMA聚类分析

·UniFrac距离组间/组内差异比较分析

⑥菌群比较分析和关键物种筛选

·PLS-DA分析

·Adonis/PERMANOVA分析

·ANOSIM分析

·随机森林分析

⑦关联网络分析

·优势物种互作Spearman关联网络分析

⑧菌群代谢功能预测

·PICRUSt功能预测分析

·功能类群分布柱状图分析

·功能类群分布小提琴图分析

·共有功能类群的Venn图分析

·结合聚类分析的功能类群热图分析

四、参考文献

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研究计划

3月底前完成样品准备

4月底前完成测序与数据分析

5月上旬对获得的数据进行处理和计算，获得调查的初步结果，并阅读大量相关文献，对所得结果进行验证。

5月下旬完成毕业论文的撰写，并在此后的时间内对毕业论文加以修改和完善。

5月底完成论文答辩。

特色与创新

少有的从凤头鹦鹉的角度探究肠道菌群与宿主之间的专一性关系，并通过肠道菌群组成判断宿主演化上的亲缘关系，有助于物种演化的研究与受威胁野生动物的保护（从肠道菌群组成来判断野生动物的生理状态，减少、预防易患的肠道疾病的发生）

指导教师

意 见

指导教师签名：

年 月 日