研究SWCNT对ATP酶活性的影响，以及CNT与溶酶体的共定位文献综述

一、基本信息

1、毕业论文（设计）来源：

（）教师科研项目的子课题；（ ）学生科研课题；

（ ）指导教师提供； （ ）自拟； （ ）其它

2、毕业论文（设计）选题类型：

（ ）基础研究； （ ）应用理论研究； （ ）应用研究

二、选题的背景及意义

正如微米技术是 20 世纪科学技术的象征, 21 世纪科学技术的象征是纳米技术. 由于纳米尺度(0.1~100 纳米, 1 纳米等于十亿分之一米)下的物质的特殊性质, 在纳米尺度控制和操纵物质(单原子或原子团簇), 对其进行加工, 制造各种功能性器械, 纳米技术几乎在各个领域具有广阔的应用前景. 纳米材料由于其尺寸很小, 结构特殊, 因此具有许多新的物理化学特性, 如小尺寸效应、大的比表面、极高的反应活性、量子效应等. 这些特性使纳米科学已经成为当今世界上三大支柱科学之一. 纳米技术的优点在于: 不仅在近期可以改造传统工业技术(如减少原料消耗,减少污染排放, 降低成本, 提高性能等), 而且在远期有希望给21 世纪的科学技术、工业和农业等领域带来革命性的变化. 随着纳米技术的产业化, 各种形式的纳米尺度的物质已经以各种不同的途径进入我们的生活. 比如, 纳米材料目前已经应用于染料、涂料、医药诊断等传统产业中, 或在生产和使用过程中直接进入人体, 或通过环境、食物链进入人体. 总之,人们在工作和生活中接触到纳米材料的机会越来越多. 纳米技术的生物安全性问题之所以受到科学家们的如此关注, 缘于一种宏观思考, 即, 纳米技术的发展是否也将带来纳米物质对人体以及生态环境的污染, 从而危及人类健康. 同时, 认识和解决这一问题, 也是促进和保障纳米科技健康和可持续发展的必要条件. 我们知道, 当物质细分到纳米尺度时, 其性质会发生很大变化, 从而导致它们在生物体内的生理行为与常规物质可能有很大的不同. 因此, 对宏观物质的安全性评价, 包括对人体健康及生态环境的影响, 也许并不适用于纳米尺度物质. 以最近的研究结果为例[6], 北京大学刘元方研究组将一种水溶性的纳米碳管(直径约1.4 nm, 长约400 nm)导入小鼠体内, 结果发现表观分子量高达60万的这种羟基化的水溶性纳米碳管可以在小鼠的不同器官之间自由穿梭, 通过尿液排泄。

碳纳米管是在 1991 年由Iijima 发现的, 它是一种完全人造的一维结构材料. 由于具有优越的力学、电子学和化学等性能, 在很多领域显示出广泛的应用前景. 比如作为高灵敏度的化学传感器, 制作超强度的电缆以及扫描探测显微镜的探针, 既可以取代铜作为导体, 也可以取代硅作为半导体. 现在单壁碳纳米管的生产能力有限, 不会对人类造成太大的危害. 但是一旦设计出便宜的大批量生产单壁碳纳米管的方法, 无疑会增大其对人类健康的影响.

1991年, Iijima在高分辨透射电子显微镜下意外观察到碳纳米管(carbonnanotubes, CNTs)之后,CNTs便成为了最受重视的纳米材料之一.CNTs具有典型的层状中空结构特征, 管身由六边形碳环微结构单元组成, 是一种径向尺寸为纳米量级、轴向尺寸为微米量级的一维量子材料.根据管壁层数的差别, CNTs一般分为单壁CNTs(single-walledCNTs,SWNTs) 和多壁CNTs (multi-walled CNTs,MWNTs)[ 1-2] .MWNTs在开始形成的时候, 层与层之间保持固定的距离, 约为0.34 nm, 直径一般大于2 nm, 层与层之间很容易成为陷阱中心而捕获各种缺陷, 因而管壁上通常布满小洞样的缺陷.与MWNTs相比, SWNTs是由单层圆柱型石墨层构成,其直径大小的分布范围小, 缺陷少, 具有更高的均匀一致性.由于CNTs独特的结构, 其研究具有重大的理论意义和潜在的应用价值, CNTs对细胞的活性和功能可能会产生重要的影响.从2003年Shvedova等[ 15] 首次报道了SWNTs能使人表皮角化细胞活性降低以来, 已有大量的文献采用多种细胞系、多样的检测手段, 研究了CNTs的毒性.作为一种碳纳米材料, CNTs相对于纳米氧化铁、纳米氧化锌、半导体量子点等纳米材料, 具有相对较小的毒性和较高的生物相容性但是,仍有众多的实验数据显示, 在一定条件下, CNTs对细胞的存活率和功能有影响, 甚至导致细胞死亡.如图1所示的研究结果, CNTs能够降低细胞的粘附能力, 提高细胞内氧化应激水平, 阻碍细胞周期.通过这些过程, 细胞可能会进一步通过凋亡/坏死的途径走向死亡.在某些情况下, 细胞本身并未死亡, 但增殖受到了抑制, 并在实验中表现为总细胞活力的降低。

三、研究的主要内容和预期目标

主要研究内容：
1. SWCNTs在不同浓度下对活细胞膜表面ATPase催化ATP降解活性的影响；
2. SWCNTs对纯化ecto-ATPase的CD光谱影响，以表征ATPase蛋白结构在CNT作用下发生的变化；
3. 合成绿色荧光标记的SWCNTs,并采用激光共聚焦显微镜对CNTs的细胞内分布进行观察；
4. 采用原位荧光免疫杂交方法对细胞溶酶体进行标记，并与CNT荧光在细胞内进行共定位，确定CNT与溶酶体的关系。

预期目标：

1、 SWCNTs对于细胞的毒理作用中可能会影响到ATP酶活性，从而对于活细胞膜表面ATPase催化ATP降解过程产生的影响。

2、 当细胞暴露在SWCNTs下时胞外ATPase可能在SWCNTs的影响下构像发生改变。这种构想的改变恰恰为ATPase活性改变带来辅助信息。

3、 能够成功得到SWCNTs与溶酶体在活细胞表面的激光共聚焦定位图谱。

四、拟采用的研究方法与步骤

圆二色谱法：主要运用圆二色性对蛋白质进行检测

圆二色性主要用于测定蛋白质的立体结构 圆二色性(circular dichroism, CD) 对R和L两种圆偏振光吸收程度不同的现象。这种吸收程度的不同与波长的关系称圆二色谱，是一种测定分子不对称结构的光谱法。在分子生物学领域中主要用于测定蛋白质的立体结构，也可用来测定核酸和多糖的立体结构。蛋白质的肽键在紫外185～240纳米处有光吸收，因此它在这一波长范围内有圆二色性。几种不同的蛋白质立体结构所表现的椭圆值波长的变化曲线──圆二色谱是不同的。如(图3[典型的蛋白质的紫外圆二色谱])所示，alpha;-螺旋的谱是双负峰形的，beta;-折叠是单负峰形的，无规卷曲在波长很短的地方出单峰。蛋白质的圆二色谱是它们所含各种立体结构组分的圆二色谱的代数加和曲线。因此用这一波长范围的圆二色谱可研究蛋白质中各种立体结构的含量。

免疫荧光：又称荧光抗体技术

免疫荧光是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。

这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。　用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。

免疫共沉淀：

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行检测，进而证明两者间的相互作用。

这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

使用仪器：圆二色谱仪，酶标仪，激光共聚焦显微镜。

五、总体安排与工作进度

3月2-5日 文献查找 基础知识学习

3月6-10日 相关药品购买，细胞株复苏

3月11-15日 细胞传代 文献阅读

3月16-20日 SIGMA公司药品到货

3月21-22 日 细胞裂解液制备 ATPase溶液配制

3月23-30 日 圆二色光谱CD检测ECTO-ATPase构象

3月31 日 细胞传代 CD数据分析

4月1-5日 文献阅读 酶标仪操作熟悉 检测试剂盒技术公告熟悉

4月6日-15日SWCNTs对纯酶体系ECTO-ATPase活性影响检测。

4月16-17 日 毕设工作中期汇报

4月18-20日 文献翻译 实验数据处理总结

4月21-30日 SWCNTs对细胞裂解液体系下ATPase活性影响实验

5月1-2 日细胞培养传代 暴露细胞准备

5月3-7日 羧基化SWCNT的荧光标记Alexa Fluorreg; 488 cadaverine

5月 8-12 日 探针标记免疫荧光实验优化

5月 13-18日 溶酶体免疫共沉淀实验

5月 19-20日 实验处理

5月 21-22日工作总结

5月 23-31日论文写作。

六、参考文献

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