焦磷酸测序用酶的表达方法及菌种保藏条件的研究
课题背景及意义
Melamede[1]等在1985年最先介绍了用序列合成来测序的原理，Hyman[2]等1988年将检测焦磷酸的方法应用到DNA测序上，Nyren[3]等人在1987年用无外切酶活性的DNA聚合酶和未标记的核苷酸完成测序过程。其原理是：测序引物与单链模板退火后，在DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下完成测序反应[4]。当加入的dNTP与模板互补时，DNA模板与互补的dNTP聚合时可以产生等摩尔PPi，在三磷酸腺苷硫酸化酶催化下，PPi与APS反应生成等量的ATP，在荧光素酶作用下，ATP与虫荧光素反应发光，最大波长约为560nm，可用光电倍增管或CCD检测。产生的荧光信号强度与聚合的dNTP个数成正比,根据加入的dNTP类型和荧光信号强度就可实时记录模板DNA的核苷酸序列[5]。焦测序技术可用于细菌病毒等的序列测定、单核苷酸多态性测定[7]、基因表达量测定和药物基因组学等的研究，具有快速、准确、经济、实时检测的特点，不需要凝胶电泳，也不需要对DNA样品进行任何特殊形式的标记和染色，有很高的可重复性、并行性和高度自动化，应用前景广阔。
然而，焦测序过程中有时会出现测序结果不准、信噪比较低的情况，原因是当模板较复杂时，形成了二级结构，影响碱基配对或导致错粘错配，出现测序不准确。单链结合蛋白(SSBP)可以阻止新形成的ssDNA重新配对形成dsDNA，并且能够防止ssDNA被核酸酶降解。SSBP使ssDNA呈伸展状态，没有弯曲和结节，具有维持ssDNA稳定、减少ssDNA二聚体的形成等作用，同时，SSBP还具有促进DNA解链的作用，也能增大含单碱基错配DNA与完全匹配DNA的解链作用的差异。将SSBP应用在焦磷酸测序中，能够减少碱基错配，显著降低测序过程中的非特异信号，提高信噪比，增加测序的准确性[6]。
本实验室已经建立了稳定、高灵敏的焦测序平台，本课题目的在于表达获得高纯度、高稳定性的DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和单链结合蛋白，对完善焦测序反应具有重要意义，也能为后续进行冻干制剂的研究提供原料。
课题拟研究问题
1.酶的表达。本课题主要表达DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和单链结合蛋白，通过基因工程技术，将编码酶的相应基因插入质粒，导入大肠杆菌，适宜条件下培养、诱导产生相应酶蛋白，再进行纯化和活力测定，得到符合焦测序实验要求的工具酶。
2.菌种保藏条件的探究。本实验室已经成功构建了表达Klenow(exo-)DNA聚合酶、酿酒酵母ATP硫酸化酶[8]、耐热荧光素酶[9]、重组大肠杆菌单链结合蛋白、生物素化荧光素酶[10]、生物素化ATP硫酸化酶[11]、小双孢菌来源的丙酮酸双磷酸激酶的工程菌[12]，通过转接、甘油冷冻等技术进行保存。
主要技术手段
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