斑马鱼lhx9基因RNA探针的构建文献综述

 2022-08-17 09:27:12

斑马鱼lhx9基因RNA探针的构建

摘要: 视紫红质细胞是视网膜神经元中最多样化的组。视紫红质中间神经元的各种亚型具有很大的图像形成和非图像形成视觉功能。目前尚不了解调控单个无长突细胞亚型发育的转录调控方法。一种此类的无长突细胞亚型包括表达神经元一氧化氮合酶（nNOS / bNOS / NOS1）的无长突细胞（NOAC），其调节一氧化氮（NO）的释放，具有神经生理递质的递质具有生理和临床意义在视网膜上。我们已经确定LIMhomeodomain转录因子LHX9是NOACs发生所必需的。在视网膜发育过程中，NOAC表达Lhx9，而Lhx9-null视网膜缺乏NOAC。 Lhx9-null视网膜在内部丛状层也显示出树突分层的像差。我们的细胞谱系追踪研究表明，表达Lhx9的细胞会同时产生GAD65和GAD67表达的GABA能amacrine细胞亚群。随着开发的进展，Lhx9在GABA能细胞的GAD65亚群中被下调，并且在很大程度上受限于amacrine细胞的GAD67亚群的影响。 NOAC是其中的一部分。综上所述，我们发现Lhx9是一种新的分子标记，可以定义amacrine细胞，并表明发展amacrine细胞NOAC亚型是必需的。原位杂交（ISH）技术可检测特定基因的表达位点。而且由于ISH条件对于每个测试的探针都相同，因此可以在胚胎发生过程中对斑马鱼基因表达进行高通量分析。

关键词：斑马鱼 探针 地高辛探针 lhx9基因 原位杂交

一、文献综述

斑马鱼( zebrafish) 在脊椎动物基因功能的研究中得到 广泛应用，并且越来越多地应用到人类遗传疾病的研究中。 基因测序发现在直系同源基因中，47%的人类基因与斑马 鱼直向同源物具有一对一的关系］。此外，斑马鱼体形小,繁殖周期短，可在实验室中进行空间高效维护。哺乳动物视网膜的复杂结构部分归因于视网膜神经元表现出的形态多样性。这种多样性进一步扩展到每个视网膜神经元类型，这些视网膜神经元类型根据其细胞形态，树突分层和/或神经递质同一性分为不同的亚型。视网膜上的无长突神经元是视网膜细胞中最多样化的类型，迄今已鉴定出约33种亚型。最近，我们已经了解到，几种视觉功能（包括图像形成和非图像形成）都是在视网膜水平上执行的，并且很大程度上受到无长突细胞亚型的调节[5-10]。尽管所有的研究都确定了负责整个无长突细胞类别发展的转录网络。 [我们才刚刚开始破译无长突蛋白亚型发展的基础的转录代码。 Amacrine interneurons表达抑制性神经递质，大致分为GABA能或甘氨酸能。GABA能的无长蛋白细胞大致分为表达GAD65或GAD67的细胞，这两种是谷氨酸脱羧酶的同工型。然而，大多数GABA能的无长突细胞都表达GAD的两种亚型]。先前的研究表明，无长绒毛细胞的多巴胺能群体为GAD65 / GAD67minus; [22]，NOAC为GAD67 / GAD65minus; [21,22]。此外，GAD65和GAD67在不同的发育时间点表达，其亚细胞定位不同，并且在大脑中具有功能上不同的特性[23]。目前尚不知道在发展范式上的差异会导致GABA能无长突细胞的不同GAD65和GAD67群体分化。 NOAC是无长突细胞的一个独特亚型，可调节一氧化氮（NO）的释放，后者是调节其他视网膜神经元生理功能的神经递质分子[24-26]。在视网膜中，NO可以选择性刺激GABA的释放，同时抑制甘氨酸的释放。此外，NO是一种重要的眼血流调节剂，NO活性异常与糖尿病性视网膜病和青光眼等多种眼病的病理有关]。NOAC分布在核内层（INL）和神经节细胞层（GCL）中。它们在内部丛状层（IPL）的中心乔木化，从ON和OFF双极细胞接收兴奋性输入，并突触到其他无长突细胞或神经节细胞上[26]。迄今为止，尚未描述NOAC亚型规范的遗传基础。以前，我们已经证明LIM-HD转录因子LHX9从大约胚胎第13.5天开始在发育中的视网膜中表达，并继续在成年视网膜的INL和GCL细胞中表达.

LIM-同源结构域（LIM-HD）转录因子在中枢神经系统发育中的作用已得到广泛研究。它们的功能是一些发育事件的关键，如细胞增殖，分化和亚型特异性。然而，它们在视网膜神经发生中的作用仍然未知。在这里，我们报告了使用免疫组织化学和原位杂交技术对LIMHD转录因子LHX9和LHX2，LHX3和LHX4和LHX6在发育中和成熟小鼠视网膜中的详细表达研究。我们显示，LHX9在视网膜神经节细胞层和内核层发育的早期阶段表达。我们还显示，LHX9在成人视网膜的无长突细胞的子集中表达。众所周知，LHX2在发育过程中在视网膜祖细胞中表达，并在成年视网膜中的Muuml;ller胶质细胞和一部分无长突细胞中表达。我们发现，无长绒毛细胞的LHX2亚型不是胆碱能的，并且很少有LHX2无长绒毛细胞表达钙调蛋白。 LHX3和LHX4在成年视网膜的双极细胞子集中表达。 LHX6从胚胎期13.5（E13.5）开始在神经节细胞层和成神经细胞层的细胞中表达，并在出生后继续在神经节细胞层和内核层的细胞中表达，表明其可能在无长突细胞中表达或其子集。综上所述，我们在小鼠视网膜发育过程中对LIM-HD转录因子表达模式的全面检测将有助于进一步研究，阐明其在视网膜细胞亚型分化中的生物学功能。

我们还创建了一个Lhx9-GFPCreER（Lhx9-GCE）小鼠细胞系，用于研究表达Lhx9的细胞的谱系。在本研究中，我们表明LHX9主要在GAD67 / GAD65- GABA能细胞中表达。一致地，我们的谱系追踪研究显示Lhx9最初在无长突细胞的GAD65和GAD67亚群中表达，但在以后的时间点仅限于无长突细胞的GAD67亚群。我们显示，NOACs在发育过程中表达Lhx9，并且有针对性地删除Lhx9菌会导致NOACs的损失，这表明Lhx9是NOACs发育所必需的。此外，Lhx9-无效的视网膜在内侧丛状层中显示出畸变，从而使famacrinecell树突状投射并破坏了IPL的组织。这些数据表明，Lhx9在NOAC的发展以及GABA能的无长蛋白细胞亚群的规格中起主要作用结果. 。

但是lhx9 与视觉的具体关系尚不清楚。进一步研究Lhx9 与 视觉发生的关系及探索其中的机制，首要问 题是揭示其在视觉发育中的表达及定位。核酸探针已被广泛用于筛选检测基因，地高辛( digoxigenin， DIG) 因其灵敏度高、特异性好、无放射性危害等优点近年来成为核酸探针的常用标记物，目前还未见 DIG 标记Lhx9 ＲNA 探针的相关报道。本课题利用RNA聚合酶在转录过程中将 DIG-11-dUTP 掺入 ＲNA 产物制 备 DIG 标记的RNA探针，并通过原位杂交技术检测小鼠视觉神经管发育中Lhx9 mRNA表达情况确定探针的效果，此探针的成功制备将为后续研究提供检测Lhx9基因的高效手段。

进行分子突变需要大量的探针拷贝，一般是通过分子克隆（molecular cloning）获得的。克隆是指用无性繁殖方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。

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