米曲霉转录因子SclR对胞内蛋白质生产的影响文献综述

 2022-08-03 16:03:30

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文献综述

1.

米曲霉

1.1

米曲霉的生物学特征

米曲霉(Aspergillus oryzae ( Asp.oryzae))是一种好气性真菌,分类学归属于半知菌亚门,丝孢纲,丝孢目,从梗孢科,曲霉属。菌落生长快,10d直径达5~6cm,质地疏松菌丝一般呈黄绿色,酸度较大的培养基上呈绿色,酸度较小的培养基上呈黄色,老化后逐渐为褐色。分生孢子梗生长在厚壁的足细胞上,分生孢子头呈放射形,顶囊球形或瓶形;分生孢子梗生长在厚壁的足细胞上,小梗一般为单层;分生孢子球形平滑,少数有刺[1]。培养适温37℃。米曲霉是一类产复合酶的菌株,除产蛋白酶外,还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达的真核生物活性蛋白的载体。米曲霉主要存在于粮食、发酵食品、腐败有机物、土壤等处,是我国传统酿造食品酱、酱油和酒类的生产菌种,其基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵的条件,这将有助于提高食品酿造业的生产效率和产品质量,也可用于生产各种酶制剂、有机酸、糖化饲料、益生素等。在众多曲霉属家族中,米曲霉占有着重要的地位。随着应用领域的蓬勃发展,人们对米曲霉的关注日渐增长。

1.2 米曲霉基因组的破译

日本研究人员历经四年零四个月时间成功的破译了米曲霉基因组,并于2005年12月在《自然》杂志上发表了分析结果米曲霉基因组大约有3800万个碱基对,共有8条染色体,包含约1.2万个基因。这一成果为从微观领域研究米曲霉打下了一个良好的基础。

1.3 米曲霉原生质体制备、再生和融合

为了更进一步研究米曲霉制备原生质体就变得尤为重要。原生质体(Protoplast)即在高渗压溶液中,用酶法将细胞壁分解除掉,下由原生质膜包住的球状胞体。它保持了原细胞的一切活性。原生质体因去掉细胞壁屏障而对诱变剂的敏感性增强、变异率提高,而且表面易形成电极性,使不同种原生质之间相互易于吸引、脱水粘合而形成聚集物,因而原生质体诱变、融合是菌种选育的一种行之有效的方法。

王燕等人利用纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶三种酶混合,并按5:3:1的配比,结果达到了最优的破除细胞壁的效果。章运等人考虑了茵龄、酶解温度、酶解时间、再生培养基的稳渗剂等多种因素,对沪酿3.042的原生质体制备与再生做了相关研究。同时此项研究也为其他米曲霉的原生质制备提供良好的思路。

1.4 米曲霉的应用

米曲霉广泛分布于粮食、发酵食品、腐败有机物、土壤等处,是我国传统酿造食品,如豆酱、酱油、酒类、低醇乳糖饮料的生产菌种,也可用于生产各种酶制剂、有机酸、糖化饲料、益生素等。在淀粉酶的作用下,将大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽以及各种氨基酸,而且可以使得辅料中的粗纤维、植酸等难吸收的物质降解,提高营养价值、保健功能和消化率[2]。

1.4.1 用于生产豆豉、豆酱

豆豉是我国古老的大豆发酵制品之一,营养丰富,对我国人民的饮食文化和医疗保健发挥着重大作用。在传统豆豉酿造工艺中,米曲霉酿造豆豉在我国应用最早、最广。《食经》等历史文献记载作豉法大都是米曲霉豆豉。当时先人们能够巧妙地控制米曲霉的最适温度,不超过37℃,“温如人腋下”,直到“后着黄衣,色均足......”。由于没有显微镜,看不到微生物的个体形态,但能通过微生物的群体形态“黄农”来控制微生物的生长繁殖。成曲以米曲霉为主,兼有其它霉菌、酵母和细菌等稳定的群体。随着科学发展,在前人基础上相继出现改良的多菌制曲和无盐固态发酵工艺,己达到相当高的水平,在生产实践中产生了良好的效果。

随着人们对食品的营养结构及保健性要求的提高虽然,酱具特有的色、香、味,然而已满足不了人民生活水平不断提高的需求。最近,日本研制了保健酱--荞麦豆酱,其除了含有17种氨基酸外,还含有其它酱品没有的芦丁(2,4rag/lOOg),在保持原有豆酱生理机能的同时,又增加了荞麦的保健性,是一种多功能的保健调味品。鞠洪荣等研究表明,在传统工艺和日本工艺的基础上进行改进,即按一定比例加入米曲霉酿造的荞麦豆酱,酱香较浓,与传统豆酱相比具有独特的醇香味,且提高了营养价值和保健效果,有潜在的市场前景。

1.4.2 与黑曲霉、绿色木霉复合发酵用于酱油生产

酱油酿造主要靠米曲霉的作用。在米曲霉生 过程中能分泌多种酶系,其中最重要的是蛋白酶、淀粉酶和酯酶等。天然发酵酱油是利用蛋白酶的水解作用,将豆类中的蛋白质降解成多肽、氨基酸等可溶性含氮物,且口味好,营养丰富,是营养性风味调料的发展方向。而淀粉酶的作用是将制曲后原料中的淀粉或经糖

化后糖浆中残留的淀粉进一步彻底糖化降解,糖化后生成的单糖类如葡萄糖、果糖、多缩戊糖等,对酱油的色、香、味、体有重要影响。因此,米曲霉所产淀粉酶的性质与酱油质量好坏密切相关。吕嘉枥等对分离纯化的米曲霉(今野菌株)所产,淀粉酶进行了研究,探索出了该菌株产,淀粉酶的培养温度和最佳培养时间。

米曲霉酶系活性的高低将直接影响到原料的利用率及产品的产率,影响酱油中可溶性含氮物的含量,从而也会影响酱油的品质,而米曲霉产孢子能力的强弱则会影响菌体繁殖的速度影响发酵速度,因此,提高米曲霉的生物活性具有重要意义。

1.4.3 用于饲料工业

猪血是一种廉价的高蛋白质资源,但因蛋白质分子量太大,血粉血腥味较重,故利用很少。血粉发酵饲料是利用微生物酶,将屠宰场废弃或处理的血粉以及辅料发酵制成的一种价格低廉、营养丰富的高蛋白饲料啊。目前,用米曲霉发酵血粉国内已有研究报道,但因选用的发酵菌种产酶能力不高且缺乏注重多种酶的复合利用,使得血粉降解不佳、饲料蛋白含量低,不利于发酵血粉的大规模利用。付祖姣等已经研究筛选出高产蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶的米曲霉,辅以细菌和酵母菌来发酵猪血粉及其配料,并摸索了种曲制各和猪血粉发酵的条件,从而生产出蛋白含量高达69%,香味浓郁,且富含游离氨基酸、维生素D 、烟酸、Fe等,消化率高、适口性好的发酵血粉饲料,作为禽畜高蛋白源或饲料添加剂。

米曲霉在复合发酵(与白地霉、黑曲霉等)生产植物性饲料方面也得到广泛的应用。我国每年的农作物秸秆产量约7亿t,占世界秸秆总产量的20%~30%。但由于农作物秸秆的粗蛋白质、矿物质、维生素含量低,特别是木质化纤维的特殊结构不利于直接利用。李爱华等研究表明用米曲霉与诱变处理后的白地霉混合发酵农作物秸秆生产蛋白饲料,是一种经济有效的方法,为养殖业提供优良的蛋白饲料,虽然不同秸秆的蛋白提高程度、不同时间和混合比例的菌种发酵存在着差异,但均可提高秸秆饲料的蛋白质含量。张贺迎等采用的是米曲霉和黑曲霉,产酶系较全,含有酸性蛋白酶、糖化酶、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶等。酸性蛋白酶作用的pH值与动物胃中的pH值相近,可弥补动物胃蛋白酶的不足,果胶酶和纤维素酶能分解植物组织,使营养物充分暴露易被分解,糖化酶的功能是将淀粉酶水解淀粉的小分了糊精进一步水解成葡萄糖,可在动物幼仔酶活力不足的阶段补充糖化酶,促进幼仔的生长,提高淀粉成分的利用率。

1.4.4 产生beta;一半乳糖苷酶消除乳糖不耐症,促进糖类的吸收

乳糖不耐症是指南于人体小肠内缺乏分解乳糖的,半乳糖苷酶饮用牛乳或乳制品后引起的对乳糖不耐受的非疾病性症状,主要表现为消化不良、腹胀、肠呜、呕吐、急性腹痛等。由于乳糖不耐症的普遍存在,使相当一部分人无法象正常人一样接受牛乳这种天然、具有良好平衡性的食品成为阻碍我国乳品工业发展的主要障碍之一。李玉强等分析了纯化的米曲霉beta;一半乳糖苷酶的酶学性质,并测定了其对牛乳和乳清中乳糖的水解程度,结果表明其水解效果已达到工业化生产低乳糖牛乳及乳清的标准,可以有效的消除人体对乳糖的不耐受症状。原因是能将乳糖水解为易吸收和甜味品质好的半乳糖和葡萄糖,又能通过半乳糖苷反应合成低聚半乳糖。该糖是双岐杆菌增值因子,难以被人体消化,能改善便秘、降低血糖、促进钙的吸收、抗龋齿等近年来倍受人们关注。[3]

1.4.5 用于酿酒制曲、生产低醇乳糖饮料

国内外使用米曲霉制曲对产酶条件的影响部作了研究,分析米曲霉制作过程中的理化性质的变化,探索其最佳的制曲条件。周立平等研究表明米曲霉糖化力可达1400mg葡萄糖/(g曲·h)产酶最适温度37℃~38℃ ,最适pH5~6,曲的糖化力和酸性蛋白酶活力较高。中国黄酒和日本清酒不同于法国的葡萄酒和德国的啤酒是因为都属于用曲霉作糖化剂发酵的酿造酒,曲霉中用的较多的微生物是米曲霉,米曲霉在酿酒过程中曲的主要作用是为酒母和酒醪提供酶源,使原料中的淀粉、蛋白质和脂肪等溶出和分解,其次在米曲霉繁殖和产酶的同时,产生葡萄糖、氨基酸、维生素等成分,为酵母提供营养来源,并生成有机酸、高级醇及

酯类等成分,再者米曲霉产生的曲香及辅料的成分,作为酒的前体物质赋予酒以独特的风味。[4]

1.4.6 发酵产氨基酰化酶及应用

氨基酰化酶是一类能专一水解N_乙酰一DL-氨基酸的酰胺键酶,由于这种立体专一性,所以很早就被用来拆分DL-氨基酸。L-型、D-型氨基酸在医药、食品、饮料等行业都有很好的应用。石开风等人对固定化菌体拆分消旋物质及酶活动力学进行初步的研究,并对拆分后产品进行初步提纯。另外,通过硫酸铵分级沉淀、SephadexG50凝胶层析和DEAE-Sepharose阴离子交换层析方法对米曲霉3.042所产氨基酰化酶进行提取,并同时考察了温度、pH值、缓冲体系的离子强度和金属离子对米曲氨基酰化酶酶活的影响。

1.5 真核生物转录子

真核生物基因表达是一个十分复杂而有序的过程,它是众多的反式因子和顺式作用元件之间相互作用的结果。基因的表达在各个层次上都受到精密的调控(包括染色体结构、转录、转录后、翻译和翻译后加工等水平的调控);转录水平的调控发生在基因表达的初期阶段,是很多基因表达调控的主要方式之一。所谓转录水平的调控是指一类称为转录因子(transcription factor, TF)的蛋白质特异地结合到靶基因调控区的顺式作用元件上,或调节基因表达的强度,或控制靶基因的时空特异性表达,或应答外界束]激和环境胁迫。

真核细胞 RN A 聚合酶自身对启动子并无特殊亲和力,单独不能进行转录,也就是说基因是无活性的。因此,转录需要众多的转录因子和辅助转录因子形成

复杂的转录装置。转录因子可以调控某些疾病相关基因转录水平,所以它可能成为潜在的治疗工具[5]。

2. bHLH 蛋白家族 2.1 bHLH 结构域

bHLH 蛋白在一段近 60 个氨基酸的片段内携有特征的序列模式,即一个螺旋-环-螺旋模体,因其上游的富含碱性氨基酸顺序而被命名。它可与相应的基因片段结合,调控基因的转录。bHLH 结构域含有一个特征序列模式——由一个 HLHM及其上游富含碱性氨基酸顺序的核酸顺序组成。bHLH 蛋白参与了细胞发育过程的研究始于骨骼肌中肌浆蛋白 D 的鉴定,后来又发现了与肌浆蛋白 D 作用相似的肌浆蛋 G、肌浆蛋白因子 5、成肌蛋白等蛋白分子。

bHLH 蛋白用同源或异源二聚体形式与 DNA 上 E-盒序列 CANNTG 结合而发挥功能。

bHLH 蛋白的碱性区域与 DNA 相连接,HLH 区域则参与形成二聚体[6]。

2.2 bHLH 蛋白家族的分类

目前 bHLH 蛋白家族根据其与 DNA 结合的能力,主要分为以下 3 类:①能够与E-盒增强子序列结合的 bHLH 蛋白,包括肌浆蛋白(myogen D,MyOD)、神经原性分化蛋白(neurogenic differentiation,Neuro D)/弹力蛋白(atonal),少突胶质细胞因子(oligodendrocyte lineage genes,OLIG)神经原质蛋白(neurogenin,NGN)/Tap,Mash/achaete-scute,E-蛋白/少分裂细胞因子(daughterless);②能够与 N-盒(N—box)抑制子序列结合的 bHLH 蛋白,包括 Hes/生毛蛋白(hairy)/断裂增强子[enhancer of split ,E(SPL)] ; ③ 不与 DNA 结合的 bHLH 蛋白,有真内皮蛋白(intradermal,Id)和细胞外基质(EMC)[7]。

3. 米曲霉 bHLH 蛋白功能研究

在以前的研究中,我们曾在米曲霉中,识别了两个 bHLH 转录因子 SclR 和 EcdR。它们通过彼此间的相互作用形成二聚体结构从而对菌核和分生孢子的形成起到重要的正/负调控作用。另一方面,在对 SclR 进行进一步功能探讨的过程中,我们发现了 sclR 基因敲除菌株与野生菌株相比,在液体培养条件下,胞内蛋白质被大量迅速的分解导致菌株形态发生重要的改变,因此可能重要的参与到米曲霉胞内蛋白质的生产或降解。目前的研究还表明转录因子 SclR 不仅对菌核形成,同时对菌丝融合, 乃至进一步的细胞核融合也有着重要的促进作用,为今后的进一步促进和实现半知菌类有性生殖开辟了新的研究视野。而不论菌丝融合技术的开发还是促进未来米曲霉获得有性生殖的可能性, 都意味着会促进米曲霉的通过杂交方式获得新性状的生产菌株育种,有利于米曲霉的进一步生产利用。尽管米曲霉 RIB40 的基因组序列已经破译,但绝大多数基因功能尚不明确,因此对米曲霉的生产利用造成很多限制。而在对各种功能基因的研究当中, 转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子。在丝状真菌中,很多蛋白质的生产表达, 次级代谢产物的生产, 甚至一些重要的菌株生长表型变化等都受到转录因子调控作用的影响。根据以上这些研究结果,我们可以看到 bHLH转录因子重要的影响菌株形态,蛋白生产和次级代谢产物的生产,因此通过对 bHLH 家族全面系统的研究,希望可以更好地提高米曲霉在发酵产业上和有用物质生产上的利用价值。

4. 植物中的 bHLH 转录因子

植物中 bHLH 家族成员数量众多,仅次于 MYB 类转录因子,譬如在拟南芥中有超过 140 个 bHLH 转录因子,水稻中则超过 160 个[8]。家族的庞大不可避免的造成功能冗余,使研究单个 bHLH 转录因子的功能相对困难。

5. 酵母双杂交体系 5.1 酵母双杂交原理

酵母 GAL4 转录因子由两个可以分开的结构域组成:DNA 结合域〔DNA binding dom ain} BD 负责结合基因的上游激活序列,将转录激活 CTranscriptionalactivation

domain AD 募集到启动子区域从而激活基因的转录。两者分开时不能激活基因转录,只有 BD 和 AD 通过一定方式在空间上足够靠近,才能发挥完整的 GAL4 转录因子活性。基于此特点,F ielcls 和 Song」设想以一对能相互作用的蛋白质为桥梁,将空间上分开的 BD 和 AD 彼此拉近,从而重建出具有活性的转录因子,以此创立了 Y 2H 系统。在该系统中,将 BD 和 AD 基因分别和诱饵蛋白 CBait)和猎物蛋白 CPrey)基因构建成融合蛋白表达载体,使其在酵母中共表达出 BD-B ait 和 AD-Prey,借助 B ait 和 P rey 的物理性相互作用使 BD 和 AD 相互靠近而产生具有功能的转录因子,进而激活 1 个或多个报告基因〔如 la cZ , H IS 3 和 U RA3 等)的转录。

5.2 有关试验操作万法的改进和探讨

在试验操作方法上做一些改进可以提高 Y 2H 的筛选效率。提高酵母转化率

会提升杂交信号的强度,更加有利于筛选。L in 等改进了酵母的醋酸铿电转化法,使用标准浓度 5 倍的转化试剂,即 0.5mo 孤的 LiAc, 50mmo 孤 T ris-H C 和 5mmo孤 ED TAC pH 7.5,对 Y 2H 常用的 3 种酵母菌株进行电转化试验,结果使转化率显著提升到 1.84 X 106 转化子准 gDNA。

不同实验室由于使用不同的双杂交系统,或不同载体、菌株和报告基因,造成各自结果之间差异很大[9] L 11 等的研究表明,培养基的不同配制方法和酵母氮源的来源不同也会影响信号的强度,以及结果是否呈现为阳性或阴性,因而认为更换培养基配方可能会减少各独立试验之间的信号差异,研究报告中培养基配制方法必须详细描述以利于不同试验结果的准确对比和进行重复研究。

在大规模的 Y 2H 矩阵筛选操作方面,为使结果更加严谨,W orseck 等[10」提出以下要求:C1/载体上使用很弱的启动子,使 B ait 和 P rey 融合蛋白极低水平表达,即用 W estern B lot 检测酵母总蛋白裂解液也不能够检出;C2)使用最严谨的报告基因〔如 HIS3gt;,即使是长期培养后,报告基因也不能在没有 P rey-B ait 相互作用时激活;C3)为检测较弱的相互作用,试验操作中必须使用新鲜的酵母菌,并进行重复试验。

5.3 酵母双杂交的应用

Y 2H 及其衍生系统的应用范围广泛,由最初的研究蛋白质之间相互作用扩展到研究蛋白质和 DNA, RNA 以及其他小分子等配体间的相互作用。在细胞信号转导、免疫学、病理学以及蛋白质组学等领域发挥重要作用。

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资料编号:[77058]

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