开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
细胞表面受体与细胞信号转导、细胞免疫等多种细胞平功能有关，它能与细胞外专一信号分子结合进而激活细胞内一系列生物化学反应，使细胞对外界刺激产生相应的效应。细胞表面受体的结构或功能异常与许多疾病的发生与发展相关，因此也是多种药物的靶标，在疾病研究中占有重要地位。
细胞表面受体大多为糖蛋白，是一种由短的寡糖链与蛋白质共价相连构成的结合蛋白质。蛋白质翻译后在到达目的位置前还要进行折叠和修饰，包括糖基化、脂基化。通过折叠，蛋白质具有了特定的空间结构，并获得一定的功能。研究蛋白结构可以帮助我们了解蛋白质与蛋白质之间、小分子与蛋白质靶标等之间的相互作用模式和机制，有助于解释致病机理，设计靶向药物。成熟明确的构效关系会极大促进对于糖蛋白类靶标的理解、应用和改造。研究蛋白结构一般采用结构生物学和分子生物学相结合的手段，而当前结构生物学研究的三大技术X-射线晶体学,核磁共振波谱学,电镜技术中，蛋白质X-射线晶体学应用最为广泛，其中得到高质量的晶体是一个重要瓶颈。
蛋白质翻译完成后如果进行糖基化修饰，便得到糖蛋白。糖基化是一种常见而且十分重要的修饰手段。糖蛋白中的糖链在维持蛋白质稳定、抵抗蛋白酶水解、防止抗体识别及参与肽链在内质网的拆叠启动等方面发挥着重要作用。但同时糖侧链对于蛋白质结晶造成阻碍，使得难以得到高质量、可用于衍射的蛋白质晶体。因此，在糖蛋白表达之后应设法切除糖侧链，同时不影响蛋白质其它部位，以利于得到有价值的蛋白结晶。目前应用比较广泛的是利用内切糖苷酶。
根据
- 蛋白质被糖类修饰形式的不同可以把蛋白质糖基化分成以下四类［O位糖基化、N位糖基化、C位糖基化和糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphophatidylinositol，GPI）锚定连接。本课题研究对象beta;-N-乙酰葡糖胺糖苷酶内切酶F1(Endo F1)，可以去除具有特定结构的N-linked的糖侧链，因此是糖蛋白结晶之前的常用工具。但由于其稳定性差，人们难以表达和纯化出具有活性并且可以长期保存的EndoF1。本研究将基于EndoF1的晶体结构，利用分子生物学技术对EndoF1进行定点突变，在大肠杆菌中实现突变体的重组表达，并通过优化表达和纯化条件，以期制备出大量稳定的、高活性的EndoF1。
基于以上研究思路，本课题拟研究或解决的问题及研究手段主要包含以下几个方面：
- EndoF1表达纯化过程中具体条件的比较、确定；
包括载体构建、标记方法；菌体破碎方法；纯化体系所用缓冲液以及常用稳定剂如beta;-巯基乙醇等的影响。
- 根据目的蛋白氨基酸序列以及对其结构的分析，确定定点突变位点
进行定点突变，在大肠杆菌中实现重组蛋白的表达。
3.酶活力检测
用表达所得蛋白来尝试切除带有相应酶切位点的糖蛋白。比较突变前后EndoF1的活性强弱和保存条件，并于市场上已有同工酶比较，评价突变意义，得到较为成熟的制备过程和保存条件，或者作出必要改进。
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