拟研究或解决的问题:
1.验证HEATR1对Nrf2的调控作用
2.通过体外和体内验证HEATR1-Nrf2信号通路在胰腺细胞癌增殖过程中的作用
研究手段:
1.细胞培养
1.1细胞复苏
将冻存的Panc-1和MiaPaCa-2细胞从液氮中取出,迅速置于37℃恒温水浴锅中,快速震摇,使细胞完全融化,然后快速喷洒酒精消毒后移至无菌超净台中。将融化的细胞混悬液转移至含有合适上述各类细胞生长的完全培养基的离心管中,在1000g下离心5min,弃上清,用6mL的适合上述各类细胞生长的完全培养基混匀细胞,转移到细胞培养瓶中。
1.2细胞培养
Panc-1和MiaPaCa-2细胞为贴壁细胞,复苏后移种至25cm2的玻璃培养瓶中,待细胞生长至铺满瓶底一侧70%-80%左右进行传代,大约每2-3天需传代一次,传代时弃去旧培养基,用1mL 0.25%的胰蛋白酶消化液消化细胞,当细胞与消化液充分接触后倒出部分消化液,瓶中留下少许的消化液继续消化大约3-5min,然后立刻加入新鲜的上述各完全培养基终止消化,缓慢的将细胞吹打均匀,应尽量避免出现气泡。按照平均分配的原则将细胞悬液转移到培养瓶内,补充新鲜培养液至6mL左右。待细胞传至3-4代时,可适当调整细胞传代密度。
2.细胞总蛋白的提取
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