ROS响应的两亲性树形分子的合成文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

1.1 本课题的目的及意义

本课题的主要研究内容为ROS响应的两亲性树形分子Bola 4A的合成与表征。

基因治疗已成为肿瘤治疗中的一种重要手段。由于小干扰RNA（siRNA）能够对与肿瘤发展及产生耐药的相关基因产生高效特异的沉默，所以基于siRNA的基因治疗在癌症的治疗中有着广阔的前景。但是siRNA的负电性很强，会自发的与生物膜相交联，同时siRNA也很容易被核酸酶降解，因此将siRNA用于基因治疗存在着是否安全与高效的问题。鉴于以上原因，我们急需开发一种兼具安全性与高递送效率的载体来递送siRNA，使其在递送过程中不被核酸酶降解，同时能够将功能性siRNA成功递送到肿瘤细胞中。

目前在siRNA递送中使用载体系统主要分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体虽然有着特异性强，转染效率高等优点，但同时存在着免疫原性和毒性等不可避免的问题。非病毒载体的优势在于其无免疫原性，同时基因递送容量大。然而非病毒载体转染效率低，特殊部位靶向性差，因此我们需要设计新型的载体来进行基因递送和治疗。

树形分子是非病毒载体中的一种，其英文名字Dendrimer来源于希腊语dendri和meros（分别意为tree-like与part of）。是一种具有三维结构的高度分支化大分子。树形分子由核，分支单元和末端基团三部分组成并且可以通过调整结构单元来改变其表面和内部的性质。其中核的部分可以影响树形分子的3D结构，分支单元能够影响树形分子的主-客体性质，并且可以对末端基团进行功能化修饰来改变树形分子表面的性质。树形分子本身既可以作为药物又可以作为载体将药物递送到靶部位，因此近年来其成为了研究热点。

树形分子主要包括聚酰胺-胺类树形分子（PAMAM）、聚丙烯亚胺树形分子（PPI）、聚L-赖氨酸树形分子（DPL）、硅碳烷型树形分子（CBS）、三嗪型树形分子以及聚甘油树形分子几类，其中PAMAM树形分子是研究比较早的一类树形分子，其末端由大量的氨基组成，表面带有大量正电荷，可以与DNA和siRNA相互作用，将其成功递送到靶部位。

树形分子每增加一代，其直径都会随末端基团数目的增加而成呈线性增长关系。低代数的树形分子结构通常比较灵活，而高代数的树形分子结构较紧凑。树形分子的代数对其整体的结构有较大的影响。PAMAM在代数达到4甚至是5代时，其结构会变得高度僵硬。通常来说，与线型的聚合物分子相比，高代数树形分子的球状结构和不同的末端基团会使得分子在溶解度和活性方面有很大的差异。因此选择适当代数的PAMAM是非常重要的。

在本课题组的前期研究工作中，我们设计合成了两亲性PAMAM树形分子。首先PAMAM树形分子作为基因递送载体，其亲水端中带有的大量正电荷可以有效压缩基因治疗药物，同时末端的氨基可以促进细胞内吞以及内涵体逃逸过程，使得载体具有很高的转染效率，与其它树形分子载体相比有着显著的优势。在PAMAM的基础上，我们进一步将其设计成了两亲性结构，使得其在生理条件下具有自组装的能力，一方面可以增加载体的长循环时间，另一方面可以通过EPR效应富集到肿瘤部位，更好的发挥疗效。为了促进siRNA在肿瘤细胞内的释放，我们考虑将微环境环境响应的敏感键引入两亲性树形分子中，使得载体在肿瘤细胞中可以解体，释放出siRNA发挥基因沉默效应。

肿瘤微环境有一系列典型的特征。如不正常血管结构，淋巴循环障碍，异常的氧化环境，组织缺氧，pH 变化梯度较低等等。由于癌细胞内的ROS水平较高，且肿瘤细胞不断增殖所导致的高压环境也会导致肿瘤细胞内不断地产生ROS，因此可以选择ROS响应的材料作为载体用于递送siRNA进行肿瘤治疗。

活性氧（ROS）是指高度反应活性的离子和游离的自由基，包括超氧化物（O ^{2 -}），羟基（OH），次氯酸根离子（OCl^-），过氧化氢（H₂O₂），单线态氧（¹O₂）等等。内源性ROS（O^{2 -}）主要由线粒体，内质网（ER），NADPH氧化酶（NOX）三个位点产生。此外，超氧化物歧化酶（SOD）和过渡金属可以通过参与O^2-和H₂O₂的反应，分别生成H₂O₂和OH。ROS在体内对于调节蛋白质功能，刺激激素的产生，调节细胞信号转导，介导炎症以及消除病原体起着至关重要的作用，而ROS的这些功能受到其数量，其响应的持续时间，及其在体内位置等多种因素的影响，缺乏ROS或过量的ROS均可能诱导自身免疫性疾病，心血管疾病，神经病变性疾病在内的多种疾病。更重要的是，ROS水平的增加会产生使细胞DNA突变的风险，而通常认为这一情况与多种肿瘤细胞的增殖密切相关。

目前活性氧（ROS）响应的药物递送系统主要包括聚合物纳米载体，水凝胶，无机纳米颗粒和可激活的前药等几类。其中各种ROS响应性连接键主要通过降解或溶解性转换（疏水性至亲水性）两种机制引发药物从载体中释放。连接键的种类，灵敏度及其在载体系统中的位置极大地影响了所载药物的药物释放动力学特性。每个链接键都有自己的优点和局限性。其中，缩硫醛键在酸性以及碱性条件下都比较稳定，而在氧化条件下可以断裂,因此我们在两亲性PAMAM分子内部引入缩硫醛键以响应于肿瘤细胞内较高水平的ROS。

综上，我们期望借鉴两亲性PAMAM树形分子的结构，设计合成一类具有ROS响应的新型两亲性树形分子。

本课题研究的Bola 4A两亲性树形分子结合了脂质体与树形分子的优点。其中Bola 4A中同时含有的亲水和疏水结构可以使化合物发生自组装，而其中独特的对于ROS敏感的缩硫醛结构能够在肿瘤细胞内ROS富集的条件下实现复合物的解组装，从而在肿瘤细胞内实现释放siRNA产生基因沉默效应，达到基因治疗的效果。另外，化合物中含有的F原子可以通过¹⁹F-NMR来追踪研究ROS响应载体的递送过程。

2、课题任务、重点研究内容、实现途径

2.1 本课题的任务

本课题的任务主要是合成Bola 4A

2.2 本课题重点研究内容

为了研究Bola 4A对肿瘤细胞的抑制作用，本课题的重点研究内容如下：

（1）ROS响应的两亲性树形分子Bola4A的合成。参考已有的文献，利用Michael加成反应以及click反应合成所需的偶联物；

（2）Bola4A的分离和表征。利用柱色谱等方法分离得到每步反应的产物，利用红外光谱（IR）、核磁共振谱（NMR）等对分离得到的产物进行结构鉴定；

2.3 实现途径

2.3.1 Bola 4A的合成

（1）对于疏水性脂质长链的合成，路线如下：

（2）对于亲水性树形分子的合成，路线如下：

（2）对于两亲性Bola 4A的合成，路线如下：

2.3.2 Bola 4A的纯化和表征

对于合成的中间体，利用柱色谱进行分离纯化，并用IR、¹H-NMR、¹³C-NMR、MS对化合物进行表征。

2.4 可行性分析

Bola 4A的脂质长链中含有ROS响应的硫缩醛连接键，在末端具有带正电荷的聚（酰氨基胺）树突，氨基末端能够与带负电荷的siRNA相互作用，将其包裹在纳米颗粒内，以保护siRNA并促进其细胞摄取。 该分子的ROS响应性增强了siRNA /载体复合物在ROS富集的癌细胞中高效和特异性解组装以用于siRNA的递送和实现基因沉默效应。 此外，这种巧妙且不同的bola-amphiphilic树状聚合物也能够组合脂质和树枝状聚合物载体的有利递送特征。

学生签名：李昕2017年 3月 18日

指导教师意见：

本课题设计思想明确，合成路线设计合理，工作量适中，难易程度一般，可以作为本科毕业论文的课题。预计在实习期间能达到预期的目标。

指导教师签名：刘潇璇2017年 3月 18日

所在教研室审查意见：

负责人签名： 年 月 日