课题背景:
龙葵是茄科(Solanaceae)植物龙葵(Solanum nigrum L.)的干燥地上部分,分布于全国各地,具有清解热毒,消肿散结,消炎利尿等功效。近年来其良好的抗肿瘤活性引起了国内外学者的广泛关注,临床上采用龙葵水煎剂或注射剂治疗宫颈癌、食道癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤,均取得了一定疗效。龙葵含有生物碱类、甾体皂苷类、多酚类等多种化学成分,其中甾体生物碱类成分被认为是龙葵抗肿瘤的活性物质,澳洲茄碱(solasonine)属其中主要成分之一。现有研究证实,澳洲茄碱对多种肿瘤细胞具有较好的抑制作用。目前关于澳洲茄碱抗乳腺癌作用的研究相对较少,且相关作用机制研究尚未见报道。本实验选择人乳腺癌SK-BR-3细胞为靶细胞,考察澳洲茄碱对SK-BR-3细胞的增殖抑制作用,并对其作用机制进行初步探讨,为澳洲茄碱在乳腺癌治疗中的应用提供实验依据。
线粒体在细胞凋亡通路中起着关键作用,线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)的丧失可引起线粒体通透性转运孔(mitochondrial permeability transition pores,MPTP)的开启与细胞色素C等凋亡因子的释放,继而激活caspase-9与caspae-3,最终导致细胞凋亡的发生。Bcl-2家族蛋白是最重要的凋亡调节因子之一,Bcl-2与Bax是该家族的两位主要成员,其中Bcl-2为抗凋亡蛋白,Bax为促凋亡蛋白。Bcl-2能够抑制MPTP的开启,抑制细胞色素C等的释放,从而抑制细胞凋亡;而Bax可以阻止Bcl-2蛋白的作用。本研究将在考察澳洲茄碱对SK-BR-3细胞凋亡诱导作用的基础上,检测线粒体通路及Bcl-2与Bax可能的介导作用。
实验流程:
实验方案:
1. 选购人乳腺癌SK-BR-3细胞,细胞用含10% 胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI 1640培养基,置于37℃,5% CO2与饱和湿度的培养箱中培养。细胞用0.25% 胰酶-0.02% EDTA 消化、传代,取对数生长期细胞用于实验研究。
2. MTT法检测澳洲茄碱对SK-BR-3细胞增殖的影响 取对数生长期SK-BR-3细胞,调整浓度为 1times;105个/mL,接种于96 孔板,每孔100 micro;L。细胞培养18~24h后进行给药实验。实验组加入含有不同浓度澳洲茄碱的RPMI 1640 培养液 200 micro;L,阴性对照组加入含有1permil; DMSO 的RPMI 1640 培养液,每组3个复孔。培养24h后,每孔加入MTT(5 mg/mL)20 micro;L,继续培养4h,弃去上清,每孔加入 DMSO 150 micro;L,振摇 10 min后用酶标仪在570 nm 波长处测定各孔吸光度值A。按照以下公式计算抑制率:抑制率(%)=(1 - 实验组平均A值/对照组平均A值)times;100%。实验重复3次。计算IC50值。
3. Hoechst 33258染色观察细胞核形态 将对数生长期的SK-BR-3细胞用胰酶消化后配制成单个细胞悬液,接种于放置盖玻片的6 孔板中培养细胞爬片生长,24h后实验组加入含有不同浓度澳洲茄碱的RPMI 1640 培养液2 mL,阴性对照组加入含有1permil; DMSO 的RPMI 1640 培养液,培养24h。多聚甲醛固定液固定细胞,PBS洗涤3次后加入Hoechst 33258染色液(10 micro;g/mL),使之充分覆盖待染色细胞,室温放置10分钟。PBS洗涤,抗荧光淬灭封片液封片后于荧光显微镜下观察。
4. JC-1染色检测细胞线粒体膜电位 将对数生长期的SK-BR-3细胞用胰酶消化后,配制成单个细胞悬液接种于6孔板中,24h后实验组加入含有不同浓度澳洲茄碱的RPMI 1640 培养液,阴性对照组加入含有1permil; DMSO 的RPMI 1640 培养液,培养24h后收集细胞。按照试剂盒操作要求进行染色处理,并进行流式细胞仪检测。以FL-1为绿色荧光检测通道,FL-2为红色荧光检测通道,并以绿色荧光率反应线粒体膜电位的变化。
5. Western blot法检测Bax与Bcl-2蛋白的表达 将对数生长期生长状态良好的SK-BR-3细胞接种于培养瓶中,培养24h。实验组加入含有不同浓度澳洲茄碱的RPMI 1640 培养液4 mL,阴性对照组加入含有1permil; DMSO 的RPMI 1640 培养液。培养24h后,收集细胞,提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白样本进行10%SDS-PAGE 电泳分离后,将蛋白转移至 PVDF 膜上。将 PVDF 膜在含5%脱脂奶粉的封闭液中封闭2h,PBST洗涤(10min times; 3)后分别加入Bcl-2、Bax 和beta;-actin的一抗于4℃孵育过夜。PBST洗涤,用相应的二抗室温孵育2h。再次用PBST洗涤后于暗室中加ECL(增强化学发光) 试剂,并将PVDF膜放入显影夹内,压片、显影、定影。
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