开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
我的毕业设计课题是硫酸氢黄连素无菌检查方法适用性研究。这次试验药品为白敬宇制药有限责任公司所生产的复方炉甘石眼膏的原料粉末——硫酸氢黄连素。
复方炉甘石眼膏，每克含炉甘石、冰片、硼砂、无水硫酸铜、硫酸氢黄连素、白芷浸膏，可用于痛痒、刺痛、眼红肿等眼疾。其中炉甘石、冰片有收敛，轻度防腐作用以及止痛消肿作用；而硼砂为天然硼酸钠，也有防腐作用，毒性极低；无水硫酸铜有收敛、腐蚀、抑菌作用。其中主要成分之一：硫酸氢黄连素（C20H18NO4·1/2SO4）又名硫酸氢小檗碱、黄连素半硫酸盐；是复方制剂复方炉甘石眼膏的成分之一；根据《中华人民共和国药典》(四部) 2020年版要求，注射剂，眼用制剂，无菌软膏剂，无菌混悬剂等很多法定药品标准中列有无菌检查项目的品种的无菌药品、医疗器具、原料、辅料、生物制品，均要求做无菌检验。故硫酸氢黄连素——系复方炉甘石眼膏的原料粉末根据药典要求需要进行无菌检查。且根据复方炉甘石眼膏成分和功效，初步推断硫酸氢黄连素也具有轻微抑菌性，故无菌检查方法适用性研究就有试验必要。该次试验样品都是由我本次的实习单位：南京白敬宇制药有限责任公司提供。
目前国内有各种药物的无菌检查方法适用性研究报告，注射剂占多数，但还没有具体的确定的针对硫酸氢黄连素的无菌检查方法标准，也没有研究小组对此进行验证，所以我选择了该课题作为自己的毕业设计研究对象。硫酸氢黄连素无菌检验方法的适用性试验确保了以后该药的无菌检验条件和方法，方便后续的检验工作的开展进行。确保临床用药安全，对我所在企业的质量管理部的微生物检验区也有一定的实践意义。
药品的无菌检查是药品质量控制的一个重要环节，系用于检查药典要求无菌的药物，生物制品，医疗器械，原料，辅料及其他品种是否无菌的方法，微生物的生长受许多因素的影响，为保证药品安全、有效，并与国际接轨，提高我国药品标准，从《中华人民共和国药典》2005年版起均要求对药品进行无菌检查，并规定了验证的方法、菌株及判断标准。本文此研究按照《中华人民共和国药典》(四部)中2020年版制剂通则中的方法对复方硫酸氢黄连素软膏进行无菌方法适用性试验,以建立无菌检查的方法。《中华人民共和国药典》2020版（四部）中1101无菌检查法明确表示进行产品无菌检查时应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若检验程序或产品变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及受控环境应定期按医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。经检查，该实验室环境均达到标准，可以进行无菌检查适应性试验。
本实验根据2020年版《中华人民共和国药典》（四部）1101无菌检查法的规定预计采用薄膜过滤法对该药进行适用性试验，为该制剂的检验和研发提供有效可靠的参考依据。过程包括菌种及菌液制备和薄膜过滤法，以及最终的结果判断。
首先，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌株及菌液制备：所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0代)，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存和确认，以保证试验菌株的生物学特性。菌液制备的过程包括：接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃ 培养18～24℃ 小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃ 培养2～3天，上述培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度菌悬液。接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃ 培养5～7天或直到获得丰富的孢子，加入适量含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸岀孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的孢子悬液。（菌悬液若在室温下放置，一般应在2小时内使用；若保存在2～8℃可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。）
薄膜过滤法中稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。根据供试品的特性，可选用其他经验证的适宜溶液作为稀释液或冲洗液（如0.9%无菌氯化钠溶液）。如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。本次试验是需要考虑其中是否需要中和剂：吐温80，可以减少无菌培养器药物残留，消除阳性菌抑菌作用，且b药物若不溶时可加吐温80以增加溶解度；冲洗剂暂定选择ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，（取磷酸二氢钾3. 56g，无水磷酸氢二钠5.77g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.00g，加水1000ml，微温溶解，必要时滤过使澄清，分装，灭菌。）有其他调整具体参考最终试验过程。薄膜过滤法的流程：首先按供试品的无菌检查要求，取每种培养基规定接种的供试品总量，采用薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入不大于100cfu的试验菌，过滤。加培养基至滤筒内，接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌的滤筒内加硫乙醇酸盐流体培养基；接种枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的滤筒内加胰酪大豆胨液体培养基。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。置规定温度培养，培养时间不得超过5天。试验中的分组可大致分为试验组（含供试品），阳性对照组（不含供试品，其他同试验组），阴性对照组三类。若最终有抑菌效果即与阳性组结果相反，未正常长出菌落，则该药物有该菌抑菌性，排除该菌作为无菌检验方法。最后，剩余菌种可用于复方硫酸氢黄连素软膏的无菌检查。
【1】《中华人民共和国药典》2020版（四部）中《1101无菌检查法》
【2】鄢雷娜,王绎,陈希,刘卫德,储梅君,刘绪平.复方黄连油涂剂无菌检查方法适用性研究[J].药品评价,2020,17(14):50-52.
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