拟研究的问题：银杏内酯生物合成相关CYP450的筛选和功能研究
采用的研究手段：本研究通过差异转录组分析，筛选在银杏根中特异性高表达的细胞色素P450酶基因，并通过酵母工程菌株进行异源CYP450基因的功能验证。
文献综述
- 银杏内酯
银杏(Ginkgo biloba L.)为银杏科(Ginkgoaceae)银杏属植物,又名白果树、公孙树、鸭脚通,是古生代二叠纪孑遗植物,被称为裸子植物的“活化石”。银杏为国家二级保护植物,它具有益心敛肺、化湿止泻的功能，用于胸闷心痛、心悸怔忡、带下病、咳嗽痰喘、泻痢等。1932年,银杏内酯化合物被Furukawa首次从银杏苦味成分中分离出来；1960年, Fujise成功分离出几个结晶；而后1967年,由Marayama等用化学方法推导出其结构[7],并确定其结构为银杏内酯A、B、C、M (Ginkgolide A,B,C,M)；80年代，其结构经500MHz NMR和X-ray得以证实;到1988年才由Corey[7]以包含26步反应的复杂而微妙的合成路线第一次完成Ginkgolide B的全合成。1987年德国的Weinges小组又从银杏叶中分离到银杏内酯J(Ginkgolide J)[7]。60年代国内外学者对银杏的化学成分、药理作用及其应用做了大量的研究工作,并获得了很好的经济效益。银杏主要含有黄酮、二萜内酯类化学成分。其中黄酮类化合物主要来源于银杏叶，含量较高，约占2.5%-6.0%，种类有83种之多。80年代又有报道,银杏叶中的银杏内酯(Ginkgolides)由于具有高度专属性拮抗血小板活化因子(Platelet Activat-ing Factor,PAF)的作用而引起国际医药界的关注。银杏内酯类化合物作为血小板活化因子的高度专属性拮抗剂,具有广泛的药理活性,其中银杏内酯B作用最强,临床上已用于治疗中风、器官移植排斥反应、休克和血液透析等[7]。但银杏叶中银杏内酯的含量甚低，为了能可持续获得这种化学成分，科学家们开展了银杏内酯生物合成的相关研究。
早在1971年，Nakanishi等用［2-14C］MVA饲喂银杏幼苗，证明了银杏内酯和白果内酯经异戊烯基焦磷酸（IPP）聚合生成香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）而生成，符合生源的异戊二烯法则。Neau等采用酶抑制剂及同位素标记的方法建立了二萜烷类与银杏内酯之间的生物合成关系，并提出了银杏内酯的生物合成途径，认为Levopimaradiene、dehydroabietane等碳氢化合物是银杏内酯的重要生物合成前体。进一步的研究表明银杏内酯是在根部合成的，随后转移到叶中储存，二者形成典型的源—池模式。2001年，Schepmann等从银杏仔苗的根部成功提取到RNA，克隆出一条全长2681bp的二萜合成酶基因，其体外表达产物可催化GGPP生成levopimaradiene。这是已证明的银杏内酯生物合成的第一步反应[1]。关于银杏内酯的生物合成途径目前已经比较清楚,其合成部位在质体中,是通过MEP途径合成的。脱氧核糖(deoxyribose)在一系列酶的作用下,形成IPP和二甲基丙烯基焦磷酸(dimethylallylpyrophos-phate,DMPP),而后合成通用的二萜前体物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranylpyrophosphate, GGPP)。银杏内酯的合成是通过促进GGPP生成玷巴基焦磷酸(labdadienyldiphosphate)而引发的。烯丙基焦磷酸离子随后通过环化、1,4-氢离子的转移、甲基的移动和脱质子化产生左旋海松二烯 (levopimaradiene)。C环脱氢形成阿松香三烯(abi-etatriene),然后经过进一步氧化和重排产生银杏内酯。
综上所述,银杏萜内酯的研究已经从单纯的成分提取和含量分析,迈入了分子生物学研究阶段。影响银杏萜内酯含量的因素很多,但是关于这方面的研究目前主要集中在含量分析上,对于相关因素对银杏萜内酯合成途径关键酶基因的表达调控鲜见报道。因此,相关基因的表达研究,特别是在不同环境或处理中的表达,以及生物合成过程中不同基因的协同表达,尚需花费大量的时间进行探索[2]。
- CYP450的功能研究
细胞色素P450(cytochrome P450,简称P450）是一类以血红素为辅基的B 族细胞色素超家族蛋白酶，是血红素蛋白大家族中极其重要的一员，通常与内质网、线粒体、质体、高尔基体等细胞器膜结合，分布在生命进化过程中的所有分支。之所以命名为P450是因为还原态P450 与一氧化碳结合后在450nm 处有一吸收峰。因其能插入一个氧原子到疏水性分子而使它们变得更具有活性或者亲水性，所以又被称为单加氧酶(mixed-function oxidase，简称MFO)。最早于1958 年在大鼠肝微粒体中被发现。1969 年，D.SFrear 首次在植物（棉花）中发现了它的存在[6]。
此后，经大量研究证实CYP450酶在植物初级和次级代谢中均发挥着关键的作用。丹参酮类化合物对心血管系统具有保护作用，被广泛用于心脑血管疾病的治疗。黄璐琦等发现[5]，CYP76AH1和CYP76AH3(CYP76AHs)是参与丹参酮生物合成的两个己知P450，其序列高度同源， CYP76AH1可催化次丹参酮二烯生成铁锈醇，CYP76AH3可羟化铁锈醇的C-11位生成11-羟基铁锈醇。青蒿素是治疗疟疾耐药性效果最好的药物。Teoh等发现［5］，CYP71AV1是青蒿素生物合成途径中的一个关键酶，其可连续催化紫穗槐二烯（amorpha-4,11-diene）生成青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸，CYP71AV1也可催化青蒿醇和青蒿醛。甘草是豆科甘草属的重要传统中药，有研究发现[5]，甘草素生物合成途径中的CYP88D6可连续氧化beta;-香树脂C-11位生成11alpha;-羟基-beta;-香树脂和11-酮-beta;-香树脂，此外，还可以氧化30-羟基-beta;-香树脂的C-11位形成30-羟基-11-酮-beta;-香树脂，CYP72A154的催化功能更广泛，其不仅可以羟化beta;-香树脂的C-30位生成30-羟基-beta;-香树脂，还可以继续氧化11-酮-beta;-香树脂的C-30位生成30-羟基-11-酮-beta;-香树脂，甘草醛和甘草次酸。紫芝是多孔菌科灵芝属的重要传统中药，孙超等发现[8]，紫芝基因组共编码228 个CYP450 基因，其中包括9 个假基因。紫芝所有的P450 基因家族在其他两个灵芝属真菌中都存在。CYP512 和CYP5144 家族可能参与灵芝酸生物合成，其中一些家族成员可能是通过基因复制进化而来的。
综上所述，由于药用植物资源稀缺、来源受限、提取工艺复杂等问题，其有效化学成分的生物合成途径研究和相关功能基因挖掘不断深入，利用合成生物学方法重组改造微生物，构建萜类合成细胞工厂，将为药用萜类生产提供一种新的思路。
- CYP450的筛选
P450几乎存在于除大肠杆菌外的所有的生命体中如：动物、植物、细菌、原生生物、古细菌和病毒。目前己知的P450结构超过20万种[6]。因此，对于研究对象生物合成相关CYP450的筛选显得尤为重要。
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