VISTA抑制剂的筛选
一、背景和原理
过去几十年来，癌症的免疫疗法取得了突飞猛进的发展。肿瘤免疫治疗种类众多，但本质上绝大多数都是通过T细胞发挥抗肿瘤作用，从传统细胞因子、多肽类药物到最新的免疫检查点抑制剂与 CAR-T细胞治疗均是间接或者直接激活人体 T细胞来清除肿瘤细胞。
目前位于免疫疗法尖端的'免疫检查点阻断剂'对于很多癌症，尤其是恶性且化学药物耐受性癌症的治疗中有着明显的效果，是近些年抗肿瘤药物开发最热门靶点。免疫检查点是人体免疫系统中起保护作用的分子，类似于刹车的作用。T细胞的激活发挥效应需要表面的共刺激分子提供活化信号，相反，T细胞表面还存在共抑制分子，他们与各自的配体结合后，能够传递信号抑制T细胞的活化，从而抑制T细胞增殖、分泌细胞因子以及杀伤肿瘤细胞，这些共抑制分子也被称为免疫检查点（1）。在生理情况下，共刺激分子与免疫检查点分子保持平衡，从而最大程度减少对于周围正常组织的损伤，维持对自身组织的耐受、避免自身免疫反应。而肿瘤细胞可以通过此机制，异常上调共抑制分子及其相关配体，抑制T细胞激活，从而逃避免疫杀伤。针对免疫检查点的阻断，是增强T细胞激活，从而激活T细胞发挥肿瘤杀伤功能的有效策略之一。其中，效果最显著的是'cytotoxic-T-lymphocyte-associated protein 4（CTLA-4）'以及'programmed cell death 1（PD-1）'两类免疫检查点阻断剂。PD-1和CTLA-4的作用都是调节T细胞活性，但是作用机制有所不同。PD-1主要在周围组织和肿瘤微环境中与它的配体PD-L1和PD-L2相互作用，从而抑制T细胞增殖、活化和分泌细胞因子；CTLA-4在T细胞表面表达，它的激活会抑制淋巴组织中T细胞活化早期的免疫应答。
二、VISTA简介
T细胞激活抑制物免疫球蛋白可变区结构域( VISTA)是可抑制T细胞应答的负向免疫检查点分子，主要表达于造血细胞，具有受体和配体的双重功能，在肿瘤微环境和肿瘤浸润淋巴结中表达升高（2-3）。VISTA 可抑制 T 细胞对肿瘤抗原的应答，抑制 T 细胞分化为调节性 T 细胞( Treg)，降低白细胞介素 2( IL- 2)的产生，具有免疫抑制和免疫调节的功能。但是VISTA并不会对B细胞的增殖产生影响（4）。VISTA与转移性黑素瘤、诱导性黑素瘤和年龄相关的炎症表型的发生相关，并且具有与不同于程序性死亡蛋白1及配体1( PD- 1 /PD-L1) 信号通路，联用VISTA /PD- 1的单克隆抗体可取得更好的治疗效果（5）。此外，VISTA在小鼠急性移植物抗宿主疾病模型上也表现出显著的调节作用。提示我们VISTA作为新发现的负向免疫检查点有望成为肿瘤免疫治疗的新靶点。
VISTA来源自National Center for Biotechnology Information的数据库，具有跟已知的传递共刺激信号的分子具有相似的免疫球蛋白可变区( immunoglobulin variable region，IgV) 。VISTA胞外IgV区与 PD- 1相似，因此VISTA 又称为 PD-1同源物 ( PD-1 homolog，PD-1H)。该蛋白是典型的1型跨膜蛋白，胞外 IgV区与 CD28 /B7 家族分子序列相似。鼠类 VISTA蛋白编码基因的可读框位于10号染色体正向链的qB4位点上，而人 VISTA 蛋白编码基因的可读框位于 10号染色体反向链的 q22 .1位点上（6-7）。人VISTA共由311个氨基酸构成，包括1个32个氨基酸构成的单独的肽链，130个氨基酸构成的单独的胞外IgV区，33个氨基酸构成的茎秆区，20个氨基酸组成的跨膜片段以及96个氨基酸组成的胞内段，而鼠源VISTA 蛋白成熟后则是共有309个氨基酸组成（8-9）。
三、研究方法和内容
本实验采用酶联免疫吸附实验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA），对待测样品与VISTA的结合情况进行测试。实验通过构建ELISA筛选模型，在蛋白层面筛选与VISTA蛋白有亲和力的短肽或小分子化合物，发现了可与之结合的多肽氨基酸序列及化合物，为VISTA抑制剂的开发提供线索和实验依据。小鼠原代T细胞可被CD-3抗体诱导激活，出现细胞增殖及产生细胞因子的现象。
本实验采用的是竞争性ELISA法筛选VISTA蛋白的亲和分子，通过简单的共孵、洗涤和显色步骤即可表征筛选对象对于VISTA蛋白亲和力的高低。主要依靠辣根过氧化物酶与TMB显色液反应发生颜色变化而进行检测。实验时将VISTA蛋白通过物理吸附作用包被在酶标板上，经过洗涤与封闭步骤去除板底存未被蛋白饱和的非特异性结合位点，再加入待测对象与VISTA特异性抗体混合物，最后加入二抗、TMB显色，检测450nm处吸光度。若检测对象不与VISTA蛋白结合，检测抗体将完全与VISTA反应，此反应组吸光度值为最大，即阳性对照。若检测对象对与VISTA蛋白结合，由于检测对象占据了VISTA蛋白的一部分结合位点，检测抗体与VISTA蛋白的结合减少，其450nm出吸光度值也会降低。利用吸光度值的强弱即可反映出筛选对象对于VISTA蛋白亲和力的高低。
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