麦冬皂苷对肿瘤坏死因子诱导的内皮炎症的保护作用研究文献综述

 2023-01-11 16:18:22

拟研究或解决的问题：

本课题拟考察麦冬皂苷对肿瘤坏死因子诱导的血管内皮炎症损伤的保护作用，并初步探讨可能的作用机制，为麦冬皂苷在调节内皮功能紊乱上提供一定的实验参考依据。

采用的研究手段：

  1. TNF-alpha;诱导C57BL/6小鼠血管炎症模型的建立

C57BL/6小鼠随机分为4组，每组5只，分别为空白组，模型组，给药组，阳性药组。给药组和阳性药组分别每天给予DT-13(4mg/Kg)和地塞米松连续(5mg/Kg)，连续灌胃13天，空白组和模型组给予等剂量的生理盐水。第7天起，灌胃1h后，模型组，给药组，阳性药组均腹腔注射TNF-alpha;（0.5mg/Kg）连续7天，空白组给以等剂量的生理盐水。第13天，腹腔注射2h后，小鼠眼球取血，静止30min后，3500rpm，4℃离心15min，去血清-70℃储存。小鼠4%多聚甲醛灌注，取腹主动脉血管置于4%多聚甲醛中2h，取出置于40%蔗糖溶液中脱水12h，取出血管包埋，冰冻切片-70℃保存。

  1. 免疫组化法测定F4/80的表达

四组每组各取两片冰冻切片，室温放置2h，4%多聚甲醛固定30min；3%冰乙酸室温浸泡20min，蒸馏水洗1-2次；滴加5%BSA封闭液，室温20min，甩去多余液体，不洗；滴加F4/80一抗(1：200，Santa Cruz ，用5% BSA配制），4℃过夜；0.01M TBS洗3次，2min/次；滴加生物素化兔抗大鼠IgG，室温20min；0.01M TBS洗3次，2min/次；滴加试剂SABC-AP，室温20min，0.01M TBS洗4次，5min/次，水洗1次；BCIP/NBT用0.01M TBS（Ph9.0-9.5）按1：20的比例稀释，混合后加至切片；室温显色30min，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤；核固红轻度复染，水洗，干燥后水溶性封片剂封片，显微镜下观察。

  1. 小鼠一氧化氮(NO)酶联免疫分析测定NO的浓度

ELISA试剂盒测定小鼠血清中一氧化氮（NO）浓度。

  1. 荧光探针考察NO的表达

HUVECs细胞以4times;105 cell/mL的细胞密度接种于96孔板，37 ℃、5% CO2培养24 h。1640培养基同化1 h，DT-13 (1 mu;M)预给药HUVECs细胞1 h后，给予TNF-alpha;刺激4 h。去除细胞培养液，加入适当体积5mu;M的DAF-FMDA。37 ℃细胞培养箱内孵育20min。用PBS（pH7.4）洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞的DAF-FMDA，显微镜下观察。

  1. 麦冬皂苷对TNF-alpha;诱导的HUVECs中eNOS的表达的影响

HUVECs细胞以4times;105 cell/mL的细胞密度接种于60 mm dish，37 ℃、5% CO2培养24 h。

1640培养基同化1 h后，考察TNF-alpha;刺激4 h后eNOS的表达。PBS洗涤2次，等量加入细胞裂解液后，提取HUVECs细胞蛋白，4 ℃裂解30 min。离心收集上清液。用BCA蛋白试剂盒测定蛋白含量。剩余的裂解液按1/5的体积加入6times;loading buffer煮沸5 min。10% SDS–PAGE分离样品蛋白并转移到PVDF膜，膜由3%牛血清白蛋白(BSA)封闭并孵育相应的一抗，4 ℃过夜。室温孵育相应的二抗2 h。由化学发光系统(ECLplus, Amersham)检测蛋白条带。

文献综述：

中药对内皮NO/eNOS/iNOS及相关通路的影响作用研究

摘要: NO是人体内一种重要的信使分子，对免疫系统、神经系统等许多生理系统具有重要调节功能，利用中药对NO/eNOS/iNOS相关通路研究可为相关疾病治疗提供新的途径。本文综述了近年来国内外对NO/eNOS/iNOS及相关通路的影响作用研究，为临床合理、有效用药提供科学依据。

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