共载纳米粒的制备和理化性质初步评价
一、研究的主要目的和意义
siRNA是一个长20到25个核苷酸的双股RNA，其两股分别在RNA的两端超出另一端2个核苷酸。siRNA在生物学上有许多不同的用途。目前已知siRNA主要参与RNA干扰（RNAi）现象，以带有专一性的方式调节基因的表达，可以使细胞中的某些基因保持沉默。此外，也参与一些与RNAi相关的反应途径，例如抗病毒机制或是染色质结构的改变。siRNA作为一种新类型的靶向治疗药物，对付迄今为止抵抗治疗的特种癌症具有潜在价值。但是，siRNA递送也面临着一些困难，具体表现为：其一是siRNA极不稳定。在血浆中，由于核酸酶的存在，siRNA的半衰期很短（t1/2lt;gt;
是故选择合适的载体材料，构建新型的药物递送系统至关重要。
近年来，人们发现，人体细胞内的细胞质、线粒体及细胞核含有高浓度的还原型谷胱甘肽（GSH）（2-10mM），此浓度是细胞外液及循环系统的100-1000倍（2-20mu;m），尤其是肿瘤组织，由于其代谢异常，导致了其细胞内GSH含量进一步增加，至少是正常细胞内环境GSH浓度的4-10倍以上。肿瘤细胞内高浓度的谷胱甘肽会导致谷胱甘肽转移酶和谷胱甘肽超氧化物酶的显著升高，这种变化已被临床应用于肿瘤的诊断。
因此，利用胞内或细胞器内生理条件与外部环境的差异，设计构建的环境触发式载体可有效地在靶点释药。还原环境敏感触发式细胞内释药系统，系针对肿瘤细胞内独特的强还原环境，利用还原物质敏感的化学键二硫键来设计、构建新型药物递送系统，以达到在靶细胞内部环境定位释药的目的。目前，国内外常将化学药物或生物类药物通过含有二硫键的化学连接臂偶联于高分子材料上形成还原敏感型大分子前体药物。如：Berthold等将核酸肽通过含有二硫键的琥珀酰亚胺基-3-2-硫代吡啶-丙酸酯（SPDP）偶联于高分子聚乙烯亚胺（PEI），结果表明该偶联物将核酸肽有效转运至细胞内，并在细胞浆高浓度GSH作用下，将核酸肽快速释放出来，作用于靶点，与不含双硫键的核酸肽-奥迪R8偶联物相比，反义活性提高10倍以上。Raghavendra等将N-乙酰半胱氨酸同样通过含有二硫键的SPDP偶联于PAMAM树状聚合物上，该体系在模拟细胞内环境的GSH浓度（~10mM）下，70%的药物在1h内释放出来，而在模拟细胞外GSH浓度（2mu;M）下，几乎没有药物释放出来。荧光标记的载体证明该聚合物能够快速将药物转至细胞浆并释放出来，疗效显著提高。然而还原敏感型大分子前体药物同样存在药物偶联量低，选择范围窄、体内到达靶细胞效率有限的问题。
不难发现吧，选择一种合适的载体材料制备还原敏感胶束可有效地改善载化疗药物和基因药物的缺陷，使其在在靶细胞内部环境定位释药。目前，制备载基因纳米粒所采用的载体材料主要有天然高分子聚合物，如壳聚糖、明胶，合成聚合物如PLA、PLGA等。而壳聚糖是一类由2-氨基-2-脱氧葡萄糖通过beta;-1,4糖甙键连接而成的带正电荷直链多糖，其提取自海洋甲壳类生物，是甲壳素脱乙酰化的产物。壳聚糖来源广泛，具有较好的生物相容性和生物可降解性，低毒，低免疫原性。而且壳聚糖基纳米粒子比微米粒子具有更多的优越性，可使大分子顺利通过上皮组织，促进药物的渗透吸收。
但是根据很多文献报道，以壳聚糖制备的还原敏感胶束靶向性不足，因此对其适当的表面修饰，可使它对特定器官或病灶具有靶向作用。透明质酸（hyaluronicacid,HA）是一种呈线性带负电的糖胺聚糖，由重复的双糖单元葡糖醛酸与N-乙酰葡糖胺通过beta;-1,3或1,4糖苷键连接而成。人体和动物体内广泛存在HA，在润滑关节、连接结缔组织中发挥重要作用，并且可维持细胞外基质结构及调节细胞内活动。HA及其衍生物目前在临床已广泛应用于关节炎治疗、眼部手术、组织工程学等。近年来，研究发现，HA是优良的抗肿瘤药物载体材料，主要具有高度的安全性、广谱肿瘤细胞靶向及结构可修饰性等优势。目前国内外主要利用HA大量的反应活性基团，将药物、尤其是抗肿瘤药物化学偶联于HA的羧基或羟基，制备抗肿瘤药物的前体药物，以改善药物溶解性、提高体内循环时间以及肿瘤靶向性。Hyukjin等通过酯键直接将紫杉醇偶联于HA，对于CD44受体过度表达的HCT-116和MCF-7细胞株，该偶联物比市售Taxol制剂表现出更大的细胞毒性，而对于不表达CD44受体的NIH-3T3细胞，该偶联物细胞毒性则显著低于Taxol，表明HA-紫杉醇前体药物可受CD44受体介导而被大量内吞至肿瘤细胞内，表现出更强的细胞毒性。Shung等以己二酸二肼（ADH）为中间臂，将阿霉素偶联于HA，该偶联物乳腺癌裸鼠皮下注射，与游离阿霉素溶液相比，可显著降低阿霉素心脏毒性，抑制乳腺癌发展进程，大大提高了动物生存率。
综上所述，鉴于肿瘤细胞表面有特异性表达透明质酸的受体，透明质酸易于被肿瘤细胞吞噬，进入血液后不易于血液内的蛋白质发生聚沉的优势，本实验将HA包裹在以壳聚糖为载体的纳米粒上，这样对其它细胞而言，这些纳米粒子看起来就像它们的原生环境，不会产生排异反应，它们可以回避免疫系统和siRNA降解酶的围追堵截而进入细胞内，实现在细胞内的高效定向释放药物。该研究将为建立安全、高效的抗肿瘤药物传递系统提供实验基础和理论依据。
二、拟研究或解决的问题
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