何首乌中蒽醌类物质对肝脏损伤的初步研究
一、背景介绍
何首乌来源于蓼科植物何首乌(Polygonum multiflorumThunb.)的干燥块根,是历版中国药典收载的品种。何首乌的主要药用部分是块根,即中药何首乌,为常用中药。以生首乌和制首乌二种形式入药。生首乌味苦、涩、性平,具有润肠、解毒、截疟之功效。生首乌经炮制后即成为制首乌,制首乌味苦、甘、涩、性温,具有补肝肾、益精血、壮筋骨、乌须发之效。在中医中，是一种常用的补益药，常用来增强肝肾功能。现代药理研究报道何首乌提取物主要有以下几方面的药理活性:降血脂、抗动脉硬化;保护肝脏作用;抗氧化、抗衰老;防辐射、抗自由基;增强机体免疫作用;改善记忆力、保护神经细胞和益智作用;抗菌、抗炎、镇痛作用。正是由于其有如此多的功效，尤其是乌须发的功效，加上何首乌其中草药制剂在市场上种类繁多，使得何首乌及其制剂在民众生活中大范围的使用。而且很多人对中草药及其制剂存在这样一种误解,认为其是天然物质,不是人工合成的化学品,因而比较安全,不良反应少。由于上述种种因素，使得何首乌及其制剂在近年来广泛应用,随着大范围和长期的使用，国内外关于何首乌引起肝损伤的不良反应报道时有出现,因此如何正确使用何首乌,使其在安全剂量范围内发挥疗效,避免不良反应的发生, 是医药工作者亟待解决的问题。
近年来的研究表明,何首乌主要含有二苯乙烯苷、蒽醌和磷脂等三大类成分。二苯乙烯苷是一类具有多种生理活性的天然成分,何首乌中已发现多种二苯乙烯苷，其中,因2, 3, 5, 4，-四羟基乙烯-2-O-beta;-D-葡萄糖苷含量高,活性明确,已成为何首乌的标志性成分,是药典对何首乌进行质量控制的指标性成分,其含量一般不少于干药材的1%。蒽醌则是蓼科植物共有的成分,何首乌总蒽醌含量约占药材干重的1.1%。何首乌蒽醌主要有大黄素、大黄素甲醚以及少量的大黄酚和大黄酸等。此外,何首乌中还含有磷脂类成分,已发现的有卵磷脂、肌醇磷脂、乙醇胺磷脂、磷脂酸、心磷脂等。目前认为，二苯乙烯苷是何首乌中的主要有效成分，而蒽醌类物质是发挥毒性作用的主要物质。为此，本实验观察了何首乌主要有效成分二苯乙烯苷及其4中蒽醌类物质大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚在不同浓度下作用不同时间对肝细胞的影响,以探讨何首乌不良反应的发生实质和有效剂量范围,也为后续的研究提供一些有用的数据，避免或减少不良反应的发生。
二、原理和研究内容
使用MTT法观察二苯乙烯苷、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚这5种成分对人肝细胞（L-02）的相对毒性大小（通过IC50）。
MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒 （Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害 。MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22mu;m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。 实验的时候一般需要关闭超净台上的日光灯来避光。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。MTT一般最好现用现配，过滤后4ordm;C避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
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