MvRS正交色氨酸氨酰tRNA合成酶的进化文献综述

一、拟研究或解决的问题

本项目拟在前期基础上，采用生物信息学手段，从基因组数据中获得aaRS/tRNA，并基因合成色氨酸aaRS及tRNA。并在细菌及哺乳动物细胞中测试其正交性，发掘潜在的正交aaRS/tRNA对，为进一步的aaRS定向进化引入ncAAs打下基础。

二、采用的研究手段

1.tRNAScTrp-TrpRS对的克隆

使用引物ScWRS-F和ScWRS-R从基因组DNA中扩增ScTrpRS，并使用PIPE克隆插入pBK质粒。使用引物pBK-PIPE-F和pBK-PIPE-R扩增载体骨架，并使用ScaI和EagI限制位点插入pRep。

2.确定抑制效率

将DH10B细胞的过夜培养物稀释至0.01的OD600，并在含有30克/毫升卡那霉素、5克/毫升四环素和不同浓度氯霉素的LB琼脂平板上点样，所述DH10B细胞与ScTrpRS和tRNA^ScTrp-质粒共转化。在37℃孵育36-48小时。

3.构建tRNA _CUA ^ScTrp-AS3.51受体干细胞库

通过重叠延伸聚合酶链反应产生的tRNA库使用NcoI/XhoI位点插入pBKCM10b。用以下随机位置的引物构建文库:ScW_tRNALb-F和ScW_tRNALb-R。如前所述进行选择实验。

4.构建ScWRS文库并选择

5.将工程化Trp-对插入pUltra抑制质粒

使用pUltra-basic作为模板和引物组合通过重叠延伸聚合酶链反应获得proK-F/tRNAh14-R和proK-R/tRNAh14-F。然后将这些片段插入SbfI和NcoI位点之间的pUltra-basic。将tRNA导入pUltra-basic后，用引物ScWRS-No-F和ScWRS-NotR扩增SCWRs，并用tacI启动子下游的NotI限制性位点插入pUltra。

6.绿色荧光蛋白的表达和纯化

用绿色荧光蛋白引物和绿色荧光蛋白引物对151位带有标签的EGFP基因进行聚合酶链反应扩增。细胞在补充有氨苄青霉素(50mu;g/ml)、大观霉素(25mu;g/ml)和2 mM非天然氨基酸的最小培养基中于37℃生长至OD ₆₀₀为0.6，此时加入IPTG至最终浓度为100mu;M。在37℃表达8小时后离心收获细胞。将细胞重悬于BugBuster蛋白质提取试剂中，并在30℃下裂解以纯化蛋白。通过离心来澄清所得细胞裂解物，并在Ni² -NTA树脂上纯化蛋白质。

7.ECFP的表达和净化

用CFP引物对66位带有标签的ECFP基因进行了聚合酶链反应扩增。用NdeI和XhoI限制性位点将聚合酶链反应产物插入pET22b载体。将具有不同ScTrpRS变异体的pET22b-CFPTrp66TAG和pUltra-tRNA_CUA^ScTrp共转化到大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中。细胞在补充有氨苄青霉素(50微克/毫升)、大观霉素(25微克/毫升)和2 mM UAA的最小培养基(GMML)中生长，在37℃至OD ₆₀₀为0.6，此时加入IPTG至最终浓度为1 mM。使用上述方案表达并进一步纯化蛋白质。

8.光谱测量

将纯化蛋白质用20mM Tris(pH=8)透析。调节蛋白质浓度，使得吸光度在0.5至1.0的范围内。在荧光分光光度计上测量蛋白质样品的荧光发射光谱。使用荧光素作为标准，通过比较蛋白质样品和荧光素的积分发射光谱，计算野生型ECFP的量子产率。用类似的方法测量其他ECFP突变体。

三、文献综述

基因密码子拓展技术文献综述

蛋白质作为生命的物质基础、生命活动的主要承担者，其功能化策略创新被认为是推动生命科学研究与产业应用转化的重要引擎之一。仅根据高度保守的密码子表来编码的20种天然氨基酸所能够进行的蛋白质结构功能的创新过于有限，在过去的20多年间里，科研人员实现了对20种天然氨基酸以外的非天然氨基酸(UnnaturalAminoAcids)的编码，而这些设计改造能够极大地拓展目前天然编码系统中有限的蛋白质构筑基元种类，对精细改造或是调控蛋白质的结构功能将起到重要的作用。

1.研究背景

1.1非天然氨基酸

自然界生物依据密码子表来对20种天然氨基酸进行编码，从而合成天然蛋白质，而这能编码天然氨基酸的遗传密码具有高度保守性，曾被认为是不可更改的。1979年，G Macino等人发现在酿酒酵母的线粒体中，终止密码UGA可以作为编码色氨酸的密码子^[1]；1988年，A Bck和TC Stadtman研究发现UGA在原核生物和真核生物中都可以被用来指导硒代半胱氨酸特异性插入到某些硒依赖性酶中^[2]。此后，越来越多的研究证明，生物体内的遗传密码存在着拓展与重编的空间。

尽管辅因子或化学修饰的方法可以大大拓展20种天然氨基酸构成的蛋白质所能承担的功能，但其仍存在着一定的局限性。基于中心法则，在过去的20多年间里科研人员实现了对20种天然氨基酸以外的非天然氨基酸(UnnaturalAminoAcids)的编码，除beta;-氨基酸和D-alpha;-氨基酸外，非天然氨基酸还包括针对特殊氨基酸侧链基团（R）设计改造的氨基酸，而这些设计改造能够极大地拓展目前天然编码系统中有限的蛋白质构筑基元种类，对精细改造或是调控蛋白质的结构功能将会起到重要的作用。

1.2非天然氨基酸的引入

蛋白质氨基酸种类的拓展可以通过向目标蛋白中引入非天然氨基酸的方式来实现，目前引入非天然氨基酸的方式包括向细胞中注射化学合成的氨酰化tRNA^[3]，或改造营养缺陷型菌株使其可利用氨基酸类似物^[4]。此外，以Peter G.Schultz等为代表的研究人员研发了一种基因密码子拓展方法，通过往细胞内引入改造后的翻译工具来实现基因编码非天然氨基酸，为拓展蛋白质的结构和功能开辟了新的路径^[5]。

基因编码非天然氨基酸其关键点是能够特异性识别非天然氨基酸的氨酰-tRNA合成酶以及能够识别空白密码子的配对tRNA的引入，以和生物体的内源性氨酰-tRNA合成酶及内源性tRNA得以区分，保证其正交性。早期研究通过对内源的氨酰-t RNA合成酶和配对tRNA进行设计改造，成功开发出在tRNA水平正交的氨酰-t RNA合成酶/t RNA配对，使其能独立于内源的工具配对行使特定的功能^[6]。另一种思路则是从进化关系较远的生物体中选择氨酰-tRNA合成酶/t RNA配对进行改造，以降低交叉反应的发生概率。目前常用的氨酰-tRNA合成酶/tRNA配对在原核生物如大肠杆菌中为古生菌来源的Methanococcus Jannaschii Tyr-RS/tRNA对和 Methanosarcina mazei/ Methanosarcina barkeri来源的Pyl-RS/tRNA，真核生物如哺乳动物细胞中则是E.coli Tyr-RS/tRNA对和Pyl-RS/tRNA对。然而目前的科学研究仅能够对有限的氨酰tRNA合成酶/tRNA对进行修饰，以完成非天然氨基酸的引入，对于潜在的正交aaRS/tRNA对及众多非天然氨基酸的编码，仍有着广阔的研究空间，以用于体内蛋白的监测，蛋白相互作用确证，蛋白药物的修饰制备，病毒等生物体的控制等领域。

1.3氨酰-t RNA合成酶/t RNA对的改造

作为细胞中最古老的酶之一，氨酰-tRNA合成酶是保证翻译过程严格按照遗传密码子表执行的核心元件。通过长期的进化，氨酰-tRNA合成酶中氨基酸结合口袋这一特定结构能特异性地识别对应的氨基酸，从而保证氨酰-tRNA合成酶对底物的正交性。因此，开发能特异性识别非天然氨基酸的工具酶需要对氨酰-tRNA合成酶中氨基酸结合口袋及其他关键结合区域进行设计改造和定向进化。

在获得了tRNA水平正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA配对基础之上，针对氨酰-tRNA合成酶的后续改造主要集中在氨基酸底物识别口袋或编辑结构域的活性位点。传统的定向进化方法通常利用连续正反向迭代筛选原理，在建立氨基酸识别口袋突变体文库之后，通过连续正选择（抗生素抗性）和反选择（毒性蛋白产生）来分离可特异性引入非天然氨基酸的氨酰-tRNA合成酶变体^[7]。氨酰-tRNA合成酶的编辑活性位点决定自身的矫正活性，用于水解错配的氨基酸，对其进行改造亦可有效提高非天然氨基酸的引入效率。而新一代蛋白质定向进化方法加速了氨酰-t RNA合成酶的开发。建立包含更多活性位点的突变体文库或者通过易错PCR获得随机突变等方法，为获得更优质的正交配对提供了可能性^[8]。此外，多元自动化基因组工程（multiplex automated genome engineering,MAGE）和噬菌体辅助持续进化（phage-assisted continuous evolution,PACE）技术也在密码子扩展工具开发过程中起到了重要作用^[9-10]。

2.国内外研究现状

2.1国内研究现状

目前，国内以北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室、分子与细胞药理学系刘涛课题组和南开大学化学学院刘育课题组为首，合作在学术期刊《Angewandte Chemie International Edition》发表了题为―A general supramolecular approach to regulate protein functions by cucurbit uril and unnatural amino acid recognition‖(葫芦脲7和非天然氨基酸主客体识别介导的通用超分子策略用于蛋白质功能调控)的研究工作。此两个课题组开发了一种结合基因密码子扩展技术和超分子主客体化学的方法,可以在蛋白质表面引入特定识别基团，从而实现对蛋白质功能的调控，并通过这种方法实现了酶和细胞因子的可逆调控,如重要药物靶点酪氨酸磷酸酶(PTP1B)以及肿瘤坏死因子TNFalpha;等,展现了研究药物靶点蛋白和调控药物蛋白的潜力。四川大学的Yingwei Wang、Li‐Fan Deng等人发现了一种从现成的半胱氨酸衍生物制备非天然氨基酸的一般方法。该方法利用分子内自由基取代过程，通过C-S裂解产生烷基自由基，在室温下温和的光催化条件中进行，此反应可用于直接合成某些难以获得的非天然氨基酸^[11]。

2.2国外研究现状

Chatterjee, A、Xiao, H、Yang, PY等人在大肠杆菌中成功诱变出可以引入非天然氨基酸的色氨酸氨酰tRNA合成酶/tRNA对^[12]，为发现更多的潜在氨酰tRNA合成酶/tRNA对提供了可以参考的技术方案与可能性；Dunkelmann, DL及其团队在应用最广泛的遗传密码扩增系统吡咯基tRNA合成酶（PylRS）/（Pyl）tRNA对的基础上生成了一组12个三重正交对^[13]，每个三重正交对由三个新的PylRS/（Pyl）tRNA对组成。并最后在一个三重正交集合内分化每对氨基酸的ncAA特异性和解码特性，并将三个不同的非标准氨基酸结合到一个多肽中，为该领域的研究提供了新的研究思路。

3.非天然氨基酸修饰蛋白质的应用现状和前景^[14]

3.1生物催化

3.1.1提高酶催化活性

在生物技术领域，酶经过化学修饰后能够在有机溶剂中高效地发挥催化作用，并表现出新颖的催化性能。现在研究者也引入许多催化基团到蛋白质中，例如细菌磷酸三酯酶PTE可以非常快的转化效率催化农药对氧磷水解，其活性已接近进化限制，这为酶的分子改造提高其活性提供了一条新的思路。

3.1.2增强酶热稳定性

特氟龙能使阻燃和防火氟化高分子材料表面固化，受此启发，纽约大学金蒙克莱尔研究小组开创了一种能增强蛋白质界面的工艺过程。借助营养缺陷性菌株和在培养基中加入对氟苯丙氨酸，制备了对氟苯丙氨酸磷酸酯酶，性能测试显示，这种酶蛋白具有类似于特氟龙的耐热性能，在60℃的高温下仍可保持结构稳定，同时活性和功能没有丝毫减弱。在同样温度下，天然蛋白质分子中的氢键会断裂，导致结构改变并发生蛋白质变性。通过此氟化氨基酸对蛋白质的修饰，给蛋白质热稳定研究开辟了新的视野。

3.2蛋白质结构和功能探针

光诱导化学反应存在于自然界中，它能调节许多细胞和生物功能，Wang等用光反应非天然氨基酸对-(2-四唑)苯丙氨酸(p-(2-tetrazole)phenylalanine,(p-Tpa))对肌红蛋白进行修饰，这给用光来调节蛋白质功能提供了可能。Lampe等用[¹³C]对甲氧基苯丙氨酸([¹³C]p-methoxyphenylalanine)对P450进行修饰，修饰后P450和其它原子结合，可以用来阐明P450在配体位点的构象改变，同时也可以解释哺乳动物P450的复杂动力学现象。

3.3药物蛋白

在医疗蛋白开发上，大量同源修饰蛋白的产生是理想的，如对许多抗原和抗原决定簇来说，一个强烈的免疫反应是必要的，Hutchins等利用校正tRNA _CUA ^Lyr /Tyr RS对，用对乙酰丙氨酸(p-acetyl-phenylalanine)对抗体抗原结合片段进行修饰，这给多聚物医疗蛋白的产生提供了可能。

3.4蛋白质交联反应

蛋白质交联在疫苗开发、药物传递、功能型水合胶方面发挥着重要作用。这些交联虽然发生在自然界中，但实验室很难应用这个方法。Ayyadurai等通过3,4-二羟-L-苯丙氨酸（3,4-dihydroxy-L-phenylalanine）对GFP蛋白进行修饰，从而实现了蛋白质与多聚糖的生物交联，这给蛋白质交联和合成生物学的发展带来了新的希望。Bundy等用对炔丙基氧苯丙氨酸（p-propargyloxyphenylalanine，（pPa））完成了二氢叶酸还原酶和超折叠绿色荧光蛋白的修饰，由于pPa含有酮基，它能在一价铜离子介导下使炔基与叠氮基发生交联反应，同时pPa对 UV不敏感，这使异源蛋白质间的交联也成为了可能。

总结：目前已开发的基因密码子拓展系统存在着翻译效率低、正交性和兼容性差等核心瓶颈，而对于正交氨酰tRNA酶/tRNA对的发掘还有着非常广阔的潜在空间，来引入更多带有所需官能团的非天然氨基酸，来实现蛋白质功能的改造，提升翻译效率与正交性，以期实现同时基因编码多种非天然氨基酸，将是该领域未来研究的重点和难点。

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