1、研究和解决的问题萜类化合物是一种结构丰富,功能多样,应用广泛的天然化合物。
通过植物提取或化学合成法获得萜类化合物的难度较大,产量有限。
随着生物分子遗传技术的发展,我们通过在模式链霉菌中重构和优化2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)途径,从而得到具有大量合成萜类化合物的合成前体物质(DMAPP和IPP)功能的底盘,并为后续在细菌中萜类化合物的发现奠定研究基础。
2、研究内容、试验设计方案研究内容:利用分子遗传操作等方式,将MEP途径的关键基因进行组合,并以番茄红素(Lycopene)表达基因CrtB、CrtE、CrtI为表征构建到质粒pSET152-ermE上。
再通过接合转移操作将目的基因整合到模式链霉菌进行异源表达。
通过发酵和颜色比对筛选出产量高的重组菌株作为高效表达萜类化合物合成前体物质的底盘,为后续在链霉菌中萜类化合物的发现和提高产量奠定研究基础。
试验设计方案:(1) 利用同源重组的方式,将番茄红素CrtB、CrtE、CrtI基因以及MEP途径的关键基因构建到pSET152-ermE质粒中;(2) 通过质粒提取、酶切验证、基因测序等方式验证出构建成功的质粒;(3) 将质粒转化到ET12567/pUZ8002感受态细胞中,并加以相应抗性的培养基进行培养,得到成功转化的大肠杆菌;(4) 利用接合转移的方式,将目的基因整合到模式链霉菌的基因组中;(5) 通过PCR验证正确的接合子,进行菌株培养,发酵;(6) 通过与对照菌株进行番茄红素颜色深度比较,筛选出最佳的高产萜类化合物的合成前体物质(DMAPP和IPP)的重组菌株。
3、文献综述萜类化合物(terpenoids)是一类具有良好应用前景的天然化合物,其结构多样,功能丰富,在自然界中分布广泛。
目前已发现的萜类化合物超过8万种,功能包括多种药理活性,可以作为重要的天然香料、甜味素以及化工原料的前体化合物[1,2],在食品、化妆品、医药和能源行业均有广泛应用。
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