一、概述
特异性赖氨酸去甲基酶1（lysine specific demethylase 1，LSD1）能够特异性脱除H3K4（组蛋白H3第4位赖氨酸）和H3K9（组蛋白H3第9位赖氨酸）的一甲基和二甲基修饰。研究表明，LSD1在多种肿瘤组织中高表达，导致组蛋白处于低甲基化状态，而异常的低甲基化过程可能与肿瘤发生相关。因此，将LSD1作为药物靶标开发抑制剂，为防治肿瘤提供了新思路。目前，LSD1抑制剂ORY-1001和GSK2879552已经进入临床Ⅰ期。在本次课题中，将合成ORY-1001并对其进行改构，ORY-1001作为阳性对照测定改构化合物的抗肿瘤活性，同时会对ORY-1001及改构化合物进行机制研究，即探究目标化合物对线粒体功能、肿瘤代谢以及糖酵解过程的影响。
二、课题背景
组蛋白是真核生物染色体的基本结构蛋白，包括H1、H2A、H2B、H3和H4五种类型，富含带正电荷的碱性氨基酸，能够同DNA中带负电荷的磷酸基团相互作用。H2A、H2B、H3和H4的各两个单体组成核心组蛋白八聚体，大约146bp长的DNA缠绕着核心组蛋白形成核小体，在核心八聚体之间则由长度约为60个碱基对的DNA连接，两个相邻的核小体之间连接的组蛋白为H1。核小体串联形成染色体。每个核心组蛋白由一个球形结构域和暴露在核小体表面的N端尾区组成，N端尾区包含大量的碱性氨基酸（赖氨酸和精氨酸）会发生多种共价修饰，主要包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖化和SUMO化，见图1。本课题主要针对组蛋白甲基化与去甲基化修饰进行研究。
组蛋白甲基化过程可以由组蛋白甲基转移酶（histone methyl transferase，HMT）调控。组蛋白H3的第4、9、27和36位，H4的第20位赖氨酸（Lys），H3的第2、17、26位及H4的第3位精氨酸（Arg）都是甲基化的常见位点。甲基化发生在组蛋白Lys和Arg侧链N原子上，赖氨酸残基能够发生单、双、三甲基化，精氨酸残基能够单、双甲基化。以往认为组蛋白的甲基化是一个不可逆的、永久性的组蛋白标记，直至2004年哈佛大学医学院发现了第一个组蛋白赖氨酸去甲基酶LSD1，证明组蛋白甲基化同其他组蛋白翻译后修饰一样是一个动态过程，通过组蛋白甲基转移酶和去甲基酶的相互作用，动态的调节组蛋白甲基化状态，调节组蛋白和其他功能蛋白的相互作用，进而调控基因转录的激活和抑制、X染色体失活等生物学过程。
LSD1是一个黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinulcleotide， FAD）依赖性胺氧化酶，能够特异性脱除组蛋白 H3K4和H3K9位点上的一甲基和二甲基修饰。在LSD1的晶体结构中，有一个N端的SWIRM （Swi3p/Rsc8p/Moira）结构域，一个C端的FAD依赖胺氧化酶结构域（amine oxidase domain，AOD），中心定位一个Tower结构域，见图2。SWIRM结构域由6个alpha;螺旋和2个beta;折叠组成，该结构域的功能是作为蛋白-蛋白相互作用的基序，很多与染色体相互作用的蛋白都含有 SWIRM 结构域。C端胺氧化酶结构域包括两个部分，FAD结合结构域和催化活性中心，是组蛋白底物的结合位点，从小分子胺到蛋白质都可能是胺氧化酶的底物。Tower结构域是C端胺氧化酶结构域向外伸出两条alpha;螺旋形成，把胺氧化酶结构域分成两个部分， 这一特殊结构对于 LSD1 的功能有着重要的作用。 LSD1去除组蛋白单甲基和双甲基修饰最有可能的催化机制是氢负离子转移。组蛋白尾部双甲基化的赖氨酸残基K661脱去1个质子转移到FAD区域的N原子上形成 FADH-，赖氨酸自身形成亚胺结构，经过水解和消除反应脱去1个甲基，FADH-经氧化又回到FAD。由于在该过程中要求赖氨酸的氮原子上有孤对电子，因此 LSD1 不能催化去除三甲基化的赖氨酸，但其他组蛋白去甲基酶，如JmjC则能通过铁离子催化的羟基化作用去除三甲基化的赖氨酸。
研究表明，LSD1在多种肿瘤组织中高表达，在肿瘤的分化、增殖、转移和侵袭方面起着重要作用。Harris[3]等通过建立白血病小鼠模型，发现抑制 LSD1能抑制从混合性白血病（mixed lineage leukaemia，MLL）患者和小鼠体内提取的白血病细胞的生长，确定LSD1能够作为MLL的药物靶标。Ding[4]等通过体外试验发现抑制LSD1可以减少结肠癌细胞的繁殖与入侵，并诱导结肠癌细胞凋亡，同时导致钙黏蛋白 E的上调与钙黏蛋白N的下调。
LSD1的抑制剂主要分为反式苯环丙胺类抑制剂、多肽类抑制剂、多胺类抑制剂，其他可逆型抑制剂以及LSD1与其他靶点的多重抑制剂[5-7]。反式苯环丙胺及其衍生物为不可逆型LSD1抑制剂，该类化合物通过与 FAD 区域结合，形成环状中间体的加合物形式，该过程不可逆转；可逆型 LSD1 抑制剂则不与 FAD 形成上述加合物形式，在作用过程中可以发生逆转。目前第一个进入临床试验的LSD1抑制剂为ORY-1001，ORY-1001是一种口服具有活性和选择性的特异性赖氨酸去甲基酶LSD1抑制剂，IC50lt;20gt;，对相关的FAD依赖性氨基氧化酶具有高度选择性。ORY-1001由ORYZON公司开发，并已作为治疗急性髓性白血病（acute myelocytic leukemia，AML）的孤儿药进入临床Ⅰ期试验，见图3A。葛兰素史克（GSK）公司也开发了相应的LSDl抑制剂GSK2879552 ，该化合物已经被FDA批准用于治疗复发性小细胞肺癌进入临床Ⅰ期，见图3B。同时GSK2879552也被证明具有抑制AML细胞增殖的能力[8]。本次课题中，通过合成ORY-1001探索其作用机制，同时对ORY-1001进行改构寻找新型高效的LSD1抑制剂。
三、进度安排
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