用LC-MS/MS方法进行鲨烯和环氧鲨烯分析方法研究文献综述

综述 理论研究

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一、实验背景

1、理化性质

鲨烯，又称角鲨烯。1916年，由日本科学家Tsujimoto 在深海Ai-zam和Heratsuno-zam 鲨鱼肝油中发现，经过分离、鉴定将其命名为Squalene。^[1]在常温下呈无色油状液体，具有令人愉快的气味,是一种高度不饱和脂肪族烃类化合物。其分子式为C30H50，化学名称为2，6，10，15，19，23六甲基2，6，10，14，18，22二十四碳六烯，属开链三萜，又称鱼肝油萜。^[2]化学结构如图1.1所示。

图1.1 角鲨烯化学结构

环氧鲨烯(2,3-oxidosqualene),又称环氧化鲨烯，是鲨烯经鲨烯环氧酶(角鲨烯单加氧酶)催化后的产物,是鲨烯转变成羊毛甾醇(lanosterol)的中间产物。在生物体内，反应首先为角鲨烯环氧酶所催化，在分子氧和还原辅酶II同时存在下形成环氧化角鲨烯，然后在非光合生物中，由由羊毛固醇合成酶（LS）催化，环化形成羊毛甾醇。在环化过程中伴随有甲基的转移，即C-14的甲基转移至C-13上，C-8的甲基转移至C-14上。^[3]化学反应式如图1.2所示。

图1.2鲨烯转变为羊毛甾醇反应式

2、鲨烯来源、功效及应用

鲨烯广泛存在于动物、植物及微生物中。其中主要的来源是深海鱼类，又以深海鲨鱼肝油内最常见。在不同种类的深海鲨鱼肝油中，鲨烯的含量也不尽相同。在其它海洋鱼类^[4]如沙丁鱼、鲑鱼等, 其体内也含有较丰富的角鲨烯, 主要存在于这些鱼肝油中的烃类组分。在非海洋性鱼类动物中, 鲨烯也有分布, 但相对而言，含量就低很多。角鲨烯还同样存在于一些日常接触的动物油脂中，如食用的牛乳脂、猪油等。在人体组织内同样也含有鲨烯，研究表明人体脂肪组织中，鲨烯含量最高, 可达到0.24mg/g^[5]

不仅于动物体内，在许多多植物的根、叶、皮等部分，也被发现有鲨烯的存在。陈全斌^[8]等利用高效液相色谱法，以外标法计算得出罗汉果种仁油中含鲨烯12.5%；梁新华等也从甘草中测出了鲨烯的存在。^[9]

鲨烯的功效非常多。鲨烯具有类似红细胞的携氧能力；鲨烯在羊毛甾醇合成酶的作用下可转化成羊毛甾醇，再转变成胆固醇，并进一步代谢生成胆汁酸和类固醇激素，故可调控动物体内胆固醇的代谢；还具有防癌抗癌的作用；有抗氧化、抗辐射能力；能抑制微生物的生长。^[6]在食品、药品及化妆品中，鲨烯的应用也日益增加。^[7]

3、分析方法

目前，常见的鲨烯分析方法大致有：高效液相色谱法^{[2，8-11]_、}气相色谱法^[11-12]、气相色谱-质谱联用^[13-14]以及超高效液相色谱法^[15]_，分析时间多为5min以上。用LC-MS/MS方法对鲨烯及环氧鲨烯进行分析比较少见。

LC－MS/MS 技术，结合了液相色谱的高分离能力和质谱提供结构信息的功能，具有灵敏度高、选择性强的优势。对于药物体内复杂样品的分析检测，不仅可以避免复杂、烦琐、耗时的分离纯化代谢物样品的步骤，而且结合药物原型成分的质谱裂解行为研究，可迅速获得原药及其代谢产物的结构信息，分析鉴定以往难于辨识的痕量成分，提高分析速度。

二、实验目的和意义

用LC-MS/MS方法对鲨烯和环氧鲨烯进行分析测定，通过对准确度、精密度、特异性、灵敏度、重现性、稳定性等方法学考察，证明该方法的可靠性、可行性。并与相关文献所提及的检测方法比较，结合实际操作，对其优缺点进行评价。

三、实验内容

1、样品制备

称取一定量鲨烯及环氧鲨烯试剂溶于三氯甲烷中配制成一定浓度的标准溶液，取一定量标准溶液加入等体积10mM乙酸铵缓冲液（用氨水调至pH=8)，混合均匀后加入600 mu;L乙酸乙酯，充分混匀后离心取上清400 mu;L，氮吹仪下吹干。用80mu;L含 0.4mg/mL BHT的乙腈复溶后进样。

2、配制流动相

流动相A相: 水-0.1%甲酸

流动相B相：乙腈：异丙醇（80：20,v/v）-0.1%甲酸

3、色谱条件

1）MS条件：离子源为大气压化学电离源（APCI）；正离子模式检测；扫描方式为多选择反应监测（MRM）；

2）UPLC条件：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18； 流速：0.60 mL/min； 柱温：40℃；

4、方法学验证

根据2010版中国药典 附录XIX -A药物质量标准分析方法验证指导原则，对此方法的专属性、线性和范围、稳定性/重复性、精密度、检测限和定量限进行验证。

四、参考文献

[[1]] Tsujimoto M. A highly unsaturated hydrocarbon in shark liver oil[J]. Journal of Industrial Engineering Chemistry ，1916，8（10）：889-896.

[2] 张喜金,苏昭仑,黄康惠.高效液相色谱法测定角鲨烯软胶囊中的角鲨烯[J].食品安全质量检测学报,2015,6(8):3108-3113

[3] 秦玉芝,赵小英,邓克勤,甾醇生物合成中的关键酶环氧角鲨烯环化酶的分子生物学研究[J]. 生命科学研究,2007,11(1):10-15

[4] 王雪涛,傅道韫,张乐沣等. 鱼肝油中脂肪酸和角鲨烯的成分研究[J].色谱,1988,6( 6):330-334.

[5] SERRIF, FABRIZIG, URBANIS. Skin surface lipid composition in different age groups in infancy and childhood[J] .Curr Med Res Opin, 1982,7(Suppl.2):23- 25.

[6] 刘纯友,马美湖,靳国锋,角鲨烯及其生物活性研究进展[J],中国食品学报,2015,15(5):147-156.

[7] 赵振东,孙震生物活性物质角鲨烯的资源及其应用研究进展[J],林产化学与工业,2004,24(3):107-112.

[8] 陈全斌,程忠泉,杨建香,罗汉果种仁油中角鲨烯的高效液相色谱分析[J],广西科学,2006,13(2):118-120.

[9] 梁新华,郑彩霞,张风侠,甘草中角鲨烯高效液相色谱法测定[J],时珍国医国药,2010,21(8):1856-1857.

[10] 陈伟珠,晋文慧,张怡评,高效液相色谱法测定角鲨烯软胶囊中的角鲨烯[J].食品研究与开发,2015,36(24):131-133．

[11] 邹海民，曹铸，曾红燕,功能食品中角鲨烯的气相和液相色谱方法比较[J].现代预防医学,2014,41(2):293-299．

[12] 王李平,林晨,蔡大川,气相色谱法测定茶油中角鲨烯的含量[J].食品工业,2015,36(2):284-286．

[13] 石金娥,于海玲,王岩,气相色谱-质谱联用测定南瓜籽油中角鲨烯的含量[J].中国油脂,2014,39(11):88-91．

[14] 张青龄，橄榄油中角鲨烯含量的气相色谱/质谱法分析,[J].福建分析测试,2011,20(3):1-4．

[15] 荣维广,刘华良,李莉,超高效液相色谱法测定保健食品中角鲨烯[J].预防医学情报杂志,2013,29(8):734-736．