杂交瘤技术制备小鼠OVA单克隆抗体
一 .课题研究背景
巨噬细胞在免疫系统中的主要作用有：1）摄取、 处理并提呈抗原给辅助性T淋巴细胞/迟发型超敏反应T淋巴细胞（TH/TD）、 B细胞, 提供活化第1信号；2）分泌白细胞介素1（IL1）等第2信号分子, 通过TH细胞活化及抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）使外源性物质得以破坏。巨噬细胞表面存在多种受体, 如免疫球蛋白超家族受体、 补体受体（CR）、 CC趋化性细胞因子受体（CCR）、 A型清道夫受体（SRA）、 甾体类激素受体（如17beta;雌二醇受体ERalpha;）、 Toll样受体（TLR）等, 巨噬细胞的免疫调节功能主要是通过这些受体而实现。其中免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily, IgSF）受体是巨噬细胞表面的一类重要受体, 参与了多种巨噬细胞诱导的免疫性疾病, 并在移植排斥反应中发挥重要作用。IgSF受体可传导抑制性或兴奋性信号, 使巨噬细胞的功能上调或下调, 从而保持免疫系统的内稳态及产生有效的免疫应答。
IgSF受体主要包括巨噬细胞Fcgamma;受体（Fcgamma;R）、 白细胞免疫球蛋白样受体（LILR）、 成对免疫球蛋白样受体（PIR）、 血小板内皮细胞黏附分子1（PECAM1/CD31）、 骨髓分化蛋白（MyD1）、 骨髓细胞上表达的触发受体（TREM）1和 白细胞分化抗原（CD）200和CD200R。
其中， Fcgamma;R与免疫球蛋白G（IgG）的Fc段有高亲和力，共有3种Fcgamma;R，分别是Fcgamma;RⅠ、 Ⅱ、 Ⅲ, 三者之间具有高同源性。Fcgamma;R Ⅰ(D64)为Mr70000的糖蛋白, 存在于单核细胞和巨噬细胞膜表面。Fcgamma;RⅠa1编码的Fcgamma;R Ⅰ胞外区, 与I g G具有高亲和力。Fcgamma;R Ⅱ（CD32）是40000的糖蛋白, 广泛表达于几乎所有骨髓细胞表面。Fcgamma;R Ⅱ不同异型的功能有所不同, Fcgamma;R Ⅱ A通过胞内信号传导引起细胞兴奋, 而Fcgamma;R Ⅱ B则主要传导抑制性信号。Fcgamma;R Ⅲ（CD16）是40~80000的糖蛋白，Fcgamma;R Ⅲ A表达于巨噬细胞、 肥大细胞及自然杀伤（NK）细胞, 而Fcgamma;R Ⅲ B则只在中性粒细胞表达。Fcgamma;R Ⅲ胞膜外区含有2个免疫球蛋白结构域, 与IgG的结合是低亲和力的。
本课题参照文献和专利，用杂交瘤技术制备小鼠OVA单克隆抗体，之后将使之与OVA结合，形成免疫复合物，去结合巨噬细胞上的Fcgamma;R，研究Fcgamma;R的激活对于巨噬细胞表型转化的作用。这其中，该课题是此项研究的第一步，对该项研究成果的准确性有着重要意义。
我们知道在动物的脾脏中有上百万种不同的B淋巴细胞系，它们具有不同的基因，所以不同的B淋巴细胞会合成不同的抗体。当机体受到抗原刺激时，抗原分子上的抗原决定簇分别激活各个B淋巴细胞，被激活的B淋巴细胞经分裂增殖形成效应B细胞（即浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个仅生成一种专一性抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆，单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，即单克隆抗体。
单克隆抗体具有理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制等优点。这些优点使其可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究，特别在抗肿瘤领域为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景。
在1975年，Kohler和Milstein在自然杂交技术的基础上，创建了杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠的脾细胞融合，形成杂交细胞系，这种杂交瘤细胞既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞可合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤细胞作单个细胞培养，可形成单细胞系。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的和结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的单克隆抗体，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能，这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。
本课题将参照大量文献，对杂交瘤技术的每一步，选择比较不同的实验方法，探索并采用最优化的实验路径得到高质量的小鼠OVA单克隆抗体，为后续研究的开展做出良好铺垫。并在实验过程中探寻和分析单克隆抗体制备过程中常见的问题和解决的方法。
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