文献综述与原理：
色氨酸是人体细胞维持活性和增殖所必需的氨基酸，它在体内主要沿犬尿氨酸途径分解代谢，该过程有三个限速酶：色氨酸 2,3-双加氧酶（Tryptophan 2,3-Dioxygenase TDO）、吲哚胺 2,3-双加氧酶1（Indoleamine 2,3-Dioxygenase 1 IDO1）和IDO2。TDO 主要表达于肝脏，催化食物来源的色氨酸，受糖皮质激素及L-色氨酸的诱导，无免疫调节活性；IDO1受多种免疫信号的调控，包括 gamma; 干扰素(interferon gamma;，IFN- gamma;)、脂多糖、肿瘤坏死因子等，它的酶解活动可以造成微环境中色氨酸的耗竭，从而抑制细胞增殖，尤其是 T 淋巴细胞的增殖，同时其代谢途径中产生的中间产物聚积可对 T 细胞产生直接溶解作用，代谢产物喹啉酸也具有神经毒性。IDO2与IDO1作用于相同底物，但催化效率明显低于IDO1，因此本实验仅对IDO1/TDO进行进行实验。 IDO由两个alpha;螺旋结构域和位于两个结构域中间的亚铁血红素组成，其中大结构域包含催化口袋，底物可在此与酶发生作用。亚铁血红素中，当Fe2 氧化成Fe3 时，IDO处于无活性状态。在体内，IDO主要依靠黄素和四氢蝶呤等辅因子保持Fe离子处在Fe2 状态，在体外，可用亚甲基蓝或抗坏血酸代替。IDO1/TDO的活性表达降低了细胞微环境中色氨酸的浓度，从而使细胞中5-羟色胺水平降低，导致抑郁；同时色氨酸的缺乏抑制了诸如T细胞、NK细胞等的增殖，造成一种免疫抑制的状态。肿瘤细胞可以利用IDO这种免疫调节的功能来逃避免疫细胞的识别与杀伤，从而发生增殖和转移。因此，IDO1和TDO可以作为阿尔茨海默症、抑郁症、癌症等疾病的靶标，用于药物的筛选。迄今为止，筛选出的IDO1/TDO抑制剂已有数十种，如色氨酸衍生物1-MT、NLG919、INCB024360等，其中，1-MT是作为与底物色氨酸最接近的抑制剂，已成为体内外实验中普遍使用的抑制剂，其Ki 34mu;M，IC50 340Mu;m。迄今为止，尚无IDO1/TDO抑制药物上市，IDO1/TDO抑制药物仍处于研发阶段。
IDO可通过对哺乳动物基因如人和鼠IDO1的cDNA进行克隆,添加HIS-TAG标记,在细菌(如大肠埃舍利希氏杆菌)中表达获得。目前，测定酶活的方法有紫外分光光度法、酶标法、荧光光谱法、放射性同位素法等，其中酶标法灵敏度较高，但检测范围较窄；荧光法干扰少、灵敏度高，但存在荧光猝灭等问题；放射性同位素法灵敏度高，但是对人体伤害较大，成本也高。另外测定IDO1的活性，还可以利用细菌脂多糖(LPS)的腹膜内给予能诱导不同组织IDO1活性,导致N-甲酰犬尿氨酸产生的原理,在测定血清中犬尿氨酸和色氨酸水平的基础上,计算犬尿氨酸/色氨酸比率来评估IDO1活性,进而进行药效/药物动力学测定。分光光度法具有简便、准确等优点，在酶浓度不是很低的情况下灵敏度也较高，本实验即采用分光光度法进行酶活测定。
研究目的：
本实验旨在探究IDO1/TDO与底物反应的各种参数，优化反应条件以建立一种适用于抑制IDO1/TDO药物筛选的酶反应实验模型。
实验内容：本实验拟采用紫外分光光度法，在321nm波长下测定IDO1/TDO催化L-色氨酸生成N-甲酰犬尿氨酸的含量，从而可以得到酶的活性，以建立一种简便、适用范围广的IDO1/TDO抑制药物体外筛选模型。实验主要包括：
（1）缓冲液ph值的优化；
（2）酶浓度（用量）的优化；
（3）反应时间的优化；
（4）反应底物浓度优化；
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