一、课题背景
靠近反密码子的修饰核苷对于核糖体正确解码mRNA非常重要。特别是谷氨酸、赖氨酸和谷氨酰胺tRNAs的第一个反密码子位置的尿苷(U34)普遍被硫代化(S2U34)，这被认为对于限制相应分裂密码子框中的摆动和有效的密码子-反密码子相互作用都是至关重要的。CTU1和CTU2复合物的失活导致 tRNA 上硫醇化的丧失，并由此可能造成翻译过程中的误读和移码，可知未修饰的 tRNA 导致的翻译缺陷会导致严重的基因组不稳定。
同时有大量研究表明tRNA修饰与肿瘤疾病密切相关。CTU1和CTU2催化tRNA碱基34位硫修饰，形成mcm(5)S(2)-U34，研究表明这两种酶在乳腺癌细胞系中的过表达会促进癌基因DEK的表达，而癌基因DEK又会促进LEF1的表达，从而导致乳腺癌细胞系迁移和侵袭能力的增强。前人研究发现CTU1和CTU2可能形成2元复合物，然而至今没有研究体外重组二者。本课题将优化参与tRNA 34位尿苷硫醇化修饰途径的URM1、CTU1、CTU2三种重要蛋白的表达，通过研究分析这三种蛋白之间的相互作用，为对以CTU1/CTU2为靶点药物设计治疗耐药恶性肿瘤提供理论支持。
- 要解决的问题
- 寻找合适的蛋白表达载体以及表达条件；
- 采取合适的方法（亲和层析，凝胶层析等）纯化目的蛋白；
- 通过Pull Down实验研究蛋白之间的相互作用。
- 可行性分析
近年来，tRNA修饰与肿瘤细胞发育的关系成为癌症治疗新方法的研究热点。通过对医学肿瘤数据库的分析，研究人员发现大部分tRNA修饰酶在肿瘤组织中高度表达，不同类型的肿瘤组织中tRNA修饰酶的表达水平不同。CTU1和CTU2参与途径5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷-tRNA的生物合成，这两种蛋白在该修饰通路中起到核心作用。其中CTU1直接结合tRNA,但目前尚不清楚它是否充当硫转移酶。CTU2可能通过与 CTU1/ATPBD3 形成异二聚体而起作用，该异二聚体将硫羧化 URM1 中的硫连接到 tRNA 的34位摆动尿苷上。通过对CTU1和CTU2对tRNA 34位摆动尿苷硫醇化修饰通路的机理研究，寻找修饰作用的活性位点，为乳腺癌等肿瘤疾病提供新的治疗方法以及抗癌药物寻找的思路。
- 研究方法和内容
在本研究计划中，我将会结合结构生物学、生物化学和细胞生物学的学科方法，探索URM1、CTU1和CTU2三种蛋白之间的相互作用。
- 使用AlphaFold预测CTU1和CTU2的结构；
- 利用SnapGene和OligoAnalyzer设计引物，通过PCR从人293细胞中获得CTU1、CTU2和URM1的目的基因，其中CTU1特别地选用巢式方法以及在反应体系中加入DMSO经行PCR获取目的基因；
- 利用同源重组技术构建pGEX-6P-1-N6xHis-GST（氨苄抗性）和pRSFDuet-1（卡纳抗性）质粒表达载体；
- 将含有目的基因的质粒载体转化至DH5alpha;感受态大肠杆菌细胞中进行质粒扩增（含羧苄抗生素和卡纳抗生素的固体培养基培养DH5alpha;大肠杆菌）；
- 从DH5alpha;大肠杆菌细胞中提取质粒，将获得的质粒表达载体设计引物进行基因测序，将没有碱基突变的质粒表达载体转化至BL21（含氨苄抗生素LB液体培养基培养）和Rosetta（含氨苄和氯霉素LB液体培养基培养）以及Rosetta-gami（含氨苄和氯霉素LB液体培养基培养）感受态大肠杆菌细胞中进行基因表达，获得所需tRNA修饰酶；
- 通过亲和层析（Ni柱）梯度洗脱，初步纯化目的蛋白；
- 通过蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB）法确定大肠杆菌细胞中目的蛋白的表达情况；
- 蛋白酶酶切去除谷胱甘肽巯基转移酶（GST-Tag）标签和小泛素相关修饰物标签（Sumo-Tag)以及组氨酸标签（His-Tag);
- 通过离子交换和凝胶层析（分子筛）等方法进一步纯化目的蛋白；
- 通过Pull Down实验研究蛋白之间的相互作用。
- 工作计划
2021年11月1日—11月31日：学习相关实验技能，查阅文献，确定课题。
2022年2月28日—3月20日：完成开题报告。
3月21日—5月10日：完成获取目的基因，表达目的蛋白并纯化，获取目的蛋白进行Pull Down等体外结合实验。
5月11日—5月20日：完成毕业论文的撰写工作。
5月21日—6月04日：完成毕业论文的评阅、答辩与修改工作。
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