丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测标准的建立及研究文献综述

题　目

丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测标准的建立及研究

题目类型

基础研究

命题来源

自拟课题

拟完成时间

2020年5月4日

一、选题依据及意义

丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase, ALT）俗称谷丙转氨酶，是糖异生和氨基酸代谢过程中一个很重要的酶，主要分布在肝脏组织中。当肝组织因病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝等原因损伤时，肝细胞中的ALT释放入血，使血清中的ALT明显增高。故ALT是临床诊断肝功能的重要指标之一。在我国，约有1.2亿乙肝病毒携带者，世界卫生组织建议对无症状乙肝病毒携带者每三个月随访检测肝功能；ALT也是献血者健康筛检的必须项目之一。常规的ALT检测方法有赖氏法、速率法和干式化学法，几种方法各有优劣，在实验室均有使用。由于ALT酶的活性不稳定，易受试剂、温度及时间等因素影响，容易造成检测结果误差较大。故本课题尝试在已有的干化学检测法的基础上进行规范改良，提高检测敏感性、缩短检测时间、增加结果的稳定性与可重复性，从而建立一套较完善的ALT干化学法检测标准。

二、研究目标与主要内容

1.研究目标：

建立一套较完善的ALT干化学法检测标准。

传统的血液ALT检测方法有赖氏法，速率法和干式化学法：

传统赖氏法所需标本及试剂量均较大，具有操作误差较小、结果较为准确、受脂血和溶血的影响较小的优点, 但操作繁琐, 检测速度较慢。在此基础上改进的赖氏微板孔测定法标本试剂用量小，操作筒单，测量速度快，但操作误差较大，易受脂血和溶血的影响；速率法需要依赖于实验室全自动生化检测系统，其试剂、校准品、质控品均可溯源，定期校准，测定结果可靠，但只能进行血浆的测试；干化学法可用于血清、血浆和全血标本中ALT 的检测，反应迅速，结果准确，操作简便，适用于ALT的即时检验，在室外或流动场所均可快速方便地获得测试结果。所以干化学法使用最为便利。故本课题尝试在已有的干化学法的基础上进行规范改良，提高检测敏感性、缩短检测时间、增加结果的稳定性与重复性，以建立一套较完善的ALT干化学检测标准。

2.主要内容：

①整理总结当前干化学法检测ALT酶活性的主流标准；②针对目前干化学法存在的不足之处进行优化；③对优化后的方法进行实验验证；④对比分析新方法的可行性，继而形成一套较完善的检测标准。

三、研究方法和手段

（一）研究方法

1.文献研究法：搜集整理ALT酶检测分析的相关研究资料，为研究做准备；

2.比较分析法：比较目前常用ALT检测分析方法之间的差异，从中找出改进的对策。在课题研究过程还结合方法的可行性，努力使课题更加完善，更有现实意义。

3.实验验证法：通过实验验证改良后的ALT酶干化学检测法的精确性、稳定性等，确定新方法可行性。

（二）研究手段

查阅知网等数据库，充分收集现有ALT检测方法的标准，进行分析对比；进行实验验证分析，建立检测分析标准。

四、参考文献目录

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活性浓度方法总则(草案)．中华医学检验杂志，1994，2：121-123.

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[17]高朝贤,朱玉兰,陈钰婷,李丽梅,张文,刘征宇,杨学琴,惠长野.微板速率法检测丙氨酸氨基转移酶的研究[J].国际检验医学杂志,2016,37(20):2841-2842 2846.

[18]申彬. 丙氨酸氨基转移酶（ALT）参考方法的建立、方法学评价及临床应用[D].山西医科大学,2019.

[19]王鹏. 人Ⅰ型丙氨酸氨基转移酶原核表达、表位分析及其抗体制备[D].重庆医科大学,2011.

[20]廖红梅. ALT1可溶性表达和单抗制备及检测方法的初步建立[D].沈阳药科大学,2009.

五、文献综述

酶的检测标准的建立由来已久，1979 年，国际临床化学与检验医学联合会（IFCC）颁布了“测定人血清(血浆)中酶催化浓度方法总则”[1]，1985年 IFCC 提出了丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）的推荐方法[2-3]，为了酶学检测结果的可比性、准确性，我国检验学会在 1994 年发表了《中华医学会检验学会酶催化浓度测定的推荐方法》第一部分《测定人血清(血浆)中酶催化浓度方法总则》[4]，1995年、1996年陆续提出了ALT、AST推荐方法(草案)[5-6]。随后，经历了温度的研究协商，1999年在西班牙开会时，将检测温度由30℃改为 37℃，重新制定37℃测定酶活性的参考方法。最后IFCC在2002年颁布了6个系列性文件，关于6个酶的参考方法[7-12]，其中第四部分和第五部分分别为 ALT 和 AST 测定的参考方法，2006 年颁布了淀粉酶的参考方法[13]，2011年颁布碱性磷酸酶的参考方法[14]。有了参考方法，也不能完全实现酶的可比性，还需要参考物质，参考物质的选择以及赋值，成立了国际检验医学溯源联合委员会（JCTLM），公布了一部分项目的参考物质，AST 的参考物质仍在研究中[15]。参考实验室应是得到认可的实验室，然后对国际公布的参考物质进行认证，参加实验室的比对，如 RELA计划，目前全球有49家实验室参加RELA计划，我国有26家参加，全球通过ALT实验室的有29家，我国占到22家，集中分布在北京、上海等地，经过几年的发展，我国的酶学参考实验室已经初步建立。以下就是近几年关于ALT酶检测方法的成果的汇总：

余桂华等[16]分别使用干化学法和速率法对血液样本进行了ALT初筛，进行初筛后的样本合格率有显著提升，证明了ALT筛查法是降低血液报废率的有效方发。由此可见ALT检测在公共卫生事业中的重要性，建立准确而快捷的ALT检测方法有意义非凡。

高朝贤等[17]用全自动酶联免疫分析系统微板速率法对ALT进行了检测，并且通过和生化仪器分析法进行的对比实验对微板速率法在临床应用进行了评估，并因为其操作性强、结果稳定可靠的优点认为微板速率法值得临床推广应用。

申斌等[18]根据IFCC和国际检验医学朔源联合会推荐的方法，建立了不含磷酸吡哆醛的改良ALT的参考方法，按照美国国家实验室标准化协会系列文件和相关文献对初步建立的改良方法进行了方法学性能的评价，从精密度、线性范围、准确度等方面进行了评价；并对Beckman DxC 800临床常规检测系统进行评价，判断常规检测系统的临床可接受性。最终成功建立了一套丙氨酸氨基转移酶的参考方法。此方案具有很高的参考性，但是缺点是比较依赖设备，无法做到方便、快捷。

王鹏等[19]利用分子克隆技术，重组表达了ALT₁的第115个氨基酸肽段，再经过离子亲和层析纯化和蛋白酶酶切等技术后制备了ALT₁特异性的多克隆抗体；利用生物信息软件对ALT₁的B细胞抗原表位进行了分析，选取了两段较好的抗原表位肽，用合成的表位肽制备了特异性的单克隆抗体。为进一步研发ALT₁的免疫学诊断试剂奠定了基础。此方案设计了新的ALT检测分析方法思路，从同功酶的角度出发，具有极大的参考价值。

廖红梅等[20]通过构建重组表达质粒和淋巴细胞杂交瘤技术制备了特异性抗ALT₁的单克隆抗体，并以此单抗为基础，初步建立了双抗体夹心免疫胶体金法检测人血清ALT₁的方法，并对此方法进行了初步的验证。此方案同样是从ALT的同功酶方向出发，并且确定了一种方便快捷的检查方式，具有巨大的参考价值。

六、工作进度安排

（一）准备阶段

1.2020年2月17日至2020年3月5日，查阅收集文献资料，确定论题，准备开题报告。

2.2020年3月6日至3月20日，进一步补充完善研究目标、内容和方法，完成开题报告。

3.由于疫情原因，进一步实验时间待定。

1. 写作阶段

实验完成，收集数据后进行写作。

（三）答辩阶段

论文答辩的具体时间由学院确定。

七、预期成果

完成丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测标准的建立及研究。