无需核酸提取、无需亚硫酸盐处理的高通量靶向甲基化精确定量技术文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一、研究背景和研究目的

　非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的猪的急性、高度接触性传染病，又称东非猪瘟或疣猪病[^[1]]。1921 年该病在肯尼亚首次被发现报道[^[2]]，从那以后它迅速传播到撒哈拉以南、非洲、高加索、俄罗斯联邦和东欧的许多国家，最近已蔓延到中国。2018 年8 月3 日， 中国辽宁发生首起国内非洲猪瘟疫情，此后全国多地出现散发疫情，至2018 年12 月25 日，全国已有23 省（区、市）共发生98 起非洲猪瘟疫情，这是非洲猪瘟首次传入中国[^[3]]。

非洲猪瘟是世界动物卫生组织（OIE）所列的必须报告的动物疫病[^[4]]。目前，国内外并没有研制出有效的非洲猪瘟疫苗，这是这是因为非洲猪瘟病毒基因组庞大，基因型众多，免疫逃逸机制复杂多样，导致非洲猪瘟疫苗研发难度极大。因此，ASF的早期检测和快速诊断是实现有效疾病控制的关键步骤。而ASF的诊断因一系列其他感染的相似性而复杂化，特别是猪瘟、猪皮炎和肾病综合征以及猪繁殖与呼吸综合征的干扰，使得高通量高灵敏度的快速诊断技术成为亟待解决的技术难题。基于此项需求，我们拟建立一种无需核酸提取的高通量非洲猪瘟即时检测技术，在保证检测特异性和灵敏度的基础上，避免了现有技术中因核酸提取而带来的大量劳动力需求、高成本及样品处理过程可能存在的差异，同时克服了目前方法在通量上的局限性，节约检测成本，提高检测通量，为非洲猪瘟的现场即时检测提供了可能性。

1. 国内外研究进展：

ASF诊断主要是检测和鉴定猪瘟病毒特异性抗原、DNA或抗体[^[5]]，应包括血清学和病毒学检测[^[6]]。

1、血清学试验

酶联免疫吸附试验是最常用的血清学试验，因为它可广泛用于筛选目的。国际兽疫局规定的检测包括使用酶联免疫吸附试验（ELISA）进行抗体筛选，并辅以免疫印迹(IB)或间接免疫荧光(IIF)作为验证试验[^[7]]。间接免疫过氧化物酶试验( IPT )经欧洲联盟参考实验室( EURL )验证，对ASF具有有效的分析和诊断灵敏度，可作为使用猪血清诊断ASF的替代性验证试验，但其分析灵敏度低于PCR检测。另外快速血清学试验，如侧向流试纸( LFD )在现场条件下易于使用，但目前的诊断性能还不是很高[^[8]]。

2、病毒学检测

许多病毒学测试目前可用于检测活病毒、抗原和基因组，包括病毒分离、酶联免疫吸附试验、荧光抗体、聚合酶链反应和等温测定。

病毒分离和HAD是ASF诊断的黄金标准[^[9]]，也是首次在无疾病地区或地区检测疾病所必需的。然而，由于这是一个费力费时的过程，它通常只用于参考实验室，需要原代细胞培养才能进行，并且需要6天才能宣布阴性结果。另一种病毒检测试验是直接免疫荧光试验（DIF）[^[10]]，它被设计用来检测涂片或感染组织切片中的ASF抗原，但它的应用受灵敏度及操作难度限制，不适合大规模检测。

如今，聚合酶链反应（PCR）已成为使用最广泛的检测方法[^[11]]，它是检测猪瘟病毒的一种灵敏、特异和快速的病毒分离替代方法，提供了比抗原酶联免疫吸附试验和脂肪测定等其他抗性别检测方法高得多的灵敏度和特异性。传统PCR和实时PCR都已经通过国际兽疫局的验证。实时聚合酶链反应( RT-PCR )被认为是检测猪瘟病毒基因组的“黄金标准”测试，而环介导等温扩增技术（LAMP）被证明是实验室诊断猪瘟的一个有价值的替代工具[^[12]]，并将补充现有的分子方法，以便在疑似猪瘟病例中提供快速鉴别诊断。与其他PCR反应不同，等温扩增可以在单一温度下使用廉价水浴进行，而不需要昂贵的热循环设备，更适合在非专业或移动实验室中使用，目前也正在开发中。有研究已经证明在资源有限的地区对ASF进行分子诊断的可行性:使用基于人工磁珠对全血和组织样本进行DNA提取[^[13]]，以及在便携式电池供电的实时聚合酶链反应热循环器上进行DNA提取[^[14]]。这种结合为临床样品中病毒的早期和快速检测提供了现场诊断方法；但该领域的核酸提取仍然耗时且具有挑战性，提取和聚合酶链反应组件通常需要冷链，限制了在偏远地区部署的能力。

大部分聚合酶链反应的广泛实施受到测试的成本、对熟练劳动力的需求以及由于提取核酸而造成的提高产量困难的限制。而对于大多数项目来说，大规模的筛查增加了对人力和财政资源的额外需求，使得已经因工作量大和资金有限而紧张的疾控系统不堪重负。这些挑战强调了技术创新在消灭疟疾中的关键重要性，除了检测ASFV所需的高灵敏度之外，还需要高通量和低成本的筛查方法。本实验室为解决由核酸提取带来的诸多限制，开发了捕获和连接探针PCR (CLIP-PCR )[^[15]]，实现了无需核酸提取的高通量疟疾检测。因此，我们拟在捕获PCR技术的基础上，结合等温核酸扩增（LAMP），开发稳健可靠的ASFV检测技术，在保证高灵敏度高通量的同时显著节省诊断时间，如果开发成功，将能够对ASF进行现场诊断。

1. 研究思路与创新点。

1、研究思路：

1.1、构建非洲猪瘟病毒基因的质粒模型：

以非洲猪瘟病毒（ASFV）DNA的P72基因作为目的基因，构建双链质粒模型。以双链环状质粒DNA或限制性内切酶酶切后的线性质粒DNA作为检测靶标。

1.2、PCR、capture PCR（C - PCR）和capture and ligation probe - PCR（CLIP - PCR）：

用实验室已经建立的C - PCR和CLIP - PCR方法与PCR方法比较，判断其检测P72基因的灵敏度和捕获效率，初步确定检测方法。

1.3、建立最优检测条件：

通过改变C - PCR或CLIP - PCR的捕获体积、捕获温度、捕获时间、探针浓度等条件，改善检测灵敏度及特异性，建立最优检测方法。

1.4、与LAMP的联用：

将检测最后阶段的荧光定量PCR（qPCR）优化成不需要变温、时间更短的环介导等温扩增（LAMP），开发适合于三小时内检测且更易操作的无需核酸提取的非洲猪瘟检测方法。

1.5、真实样品检测：

将优化好的ASFV诊断方法应用于采集的病猪的血样检测

1. 创新点：

拟建立一种基于捕获方法的无需核酸提取的高通量非洲猪瘟即时检测技术，具有比非PCR检测技术更高的特异性和灵敏度，并且避免了PCR检测技术中因核酸提取而带来的大量劳动力需求、高成本及样品处理过程可能存在的差异，同时克服了目前方法在通量上的局限性，节约检测成本，提高检测通量，为非洲猪瘟的现场即时检测提供了可能性。参考文献[1] Alejo A, Matamoros T, Guerra M, et al. A proteomic atlas of the African swine fever virus particle［J］. J Virol, 2018,92(23):e01293-18.[2] Montgomery RE. On a form of swine fever occurring in British East Africa (Kenya Colony)[J]. Journal of Comparative Pathology and Therapeutics, 1921, 34: 159-191[3] 李硕,张云辉,王永怡,李军,赵雅琳,闫晶晶,孙志杰,揣征然,姬军生. 2018年国内外传染病领域重要事件回顾[J]. 传染病信息,2019,(01):8-15.[4] 世界动物卫生组织必须报告动物疫病名录[EB/OL].[2015-6-9].http://www.oie.int/animal-health-in-the-world/oielisted-diseases-2015/.

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[6] Saacute;nchez-Vizcaiacute;no J M, Mur L. African swine fever diagnosis update[M]//Vaccines and diagnostics for transboundary animal diseases. Karger Publishers, 2013, 135: 159-165.

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学生签名：

年 月 日

指导教师意见：

指导教师签名： 年 月 日

所在教研室审查意见：

负责人签名： 年 月 日