开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 课题背景
1.背景介绍
蛋白质在细菌中分布广泛，参与细菌的构建，参与细菌内的生理生化反应，还有着传递信息等功能，细菌的蛋白质还与细菌致病性有关。细菌的正常生长依赖于大量蛋白质的有效合成，正确合成的蛋白质具有生物学活性和相关功能，是细菌生长和繁殖的基础。在合成量如此庞大的体系中会因为各种各样的因素导致翻译过程停滞，这不仅会产生错误的肽段，还会导致核糖体得不到释放，影响后续蛋白质的合成。如果不解决这些错误的蛋白质，会导致细菌中毒，使细菌生存能力大大减弱。因此细菌具有多种蛋白降解途径，tmRNA介导的反式翻译是降解方式的其中一种。正因为反式翻译过程对细菌的生长繁殖至关重要，因此反式翻译的过程是很好的抗菌靶点，通过阻碍反式翻译的正常进行来达到杀菌的目的[1]。
2.tmRNA的结构和功能
tmRNA同时具有tRNA和mRNA的作用，也被称为aRN10SA，ssrA RNA,它在细菌中广泛存在。不同的细菌tmRNA的长度不同，通常在260-430bp之间[1]。tmRNA含有十二个螺旋和四个假结体，在螺旋4和5之间存在一段编码ssrA蛋白降解标签的单链RNA[2]。tmRNA一部分结构类似于tRNA,另一部分类似于mRNA，类似tRNA的部位是tmRNA和核糖体结合的关键部位，含有SmpB等反式翻译所必须的蛋白的作用位点[1]，该部位使tmRNA和核糖体结合，同时释放出未完成翻译的mRNA。类似于mRNA的结构则可翻译出蛋白质标签，引导蛋白质降解。
tmRNA介导的过程称为反式翻译。在细菌核糖体翻译不含终止密码子的mRNA时，会导致核糖体停滞，tmRNA中类似tRNA的区域可携带Ala氨基酸，与SmpB蛋白、核糖体蛋白s1，延伸因子等形成复合体。SmpB可以稳定tmRNA的结构，促使其携带上Ala发生氨酰化，同时也帮助tmRNA和核糖体结合[3,12]。复合物进入核糖体后促使未翻译完的mRNA释放，肽段通过转肽作用转移到Ala上，形成肽键。紧接着核糖体会翻译编码ssrA蛋白标签的单链RNA序列，遇到tmRNA的终止密码子后停止翻译，释放出含ssrA蛋白降解标签的肽段[3]。除了缺乏终止密码子的mRNA会引起反式翻译外，精氨酸稀有密码子成簇出现以及密码子对应的tRNA缺乏也会引起反式翻译[4]。较弱的密码子可以使翻译终止，也可以引发反式翻译过程，这两者之间存在竞争的关系[5]。tmRNA使细胞中其余的蛋白质翻译过程不受影响，释放出停滞的核糖体，并且在蛋白质末端添加上一段ssrA降解序列，清除异常蛋白质[6] 。研究表明，ssrA介导的蛋白质降解受到温度的影响，具有温度依赖性[7]。tmRNA还可作为反义RNA调节金黄色葡萄球菌色素的合成[8]。ssrA突变体对多种抗生素表现出敏感性。其中包括丝裂霉素C[9],庆大霉素，四环素等[10]，因此tmRNA和细菌的抗药性有关，对细菌的生长繁殖起到了重要作用。
3.ssrA蛋白序列的功能
ssrA标签可引导蛋白质进入蛋白酶复合体ClpXP进行特异性降解，ClpX可识别ssrA蛋白序列并水解ATP提供能量,蛋白质进入ClpP形成的筒状结构中进行水解，完成错误肽段的降解，蛋白酶对底物的识别依靠ssrA蛋白序列[11]。现在所发现的ssrA序列通常是十一个氨基酸序列AANDENYALAA。Keiler等人发现LAA是酶切割的位点[13]。
- 研究目的
对于tmRNA翻译形成的ssrA蛋白标签，众多学者认为这个序列必须是LAA结尾的保守序列(AANDENYALAA)。Eric D.Roche 等人构建的ssrA突变体所形成的蛋白标签为AANDENYALDD，该突变体不可以降解翻译出现问题的蛋白质[4]。本课题前期偶然发现ssrA蛋白标签后接上GDSA序列即AANDENYALAAGDSA竟然能被降解。因此本研究拟在ssrA蛋白标签后接上不同种类和数量的氨基酸，观察蛋白标签是否对错误的蛋白质具有降解作用，若具有降解作用，则改变了这个序列必须是LAA结尾的保守看法，后续将验证ssrA标签后能够容纳多少个氨基酸。
三、研究方法
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