开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
p97蛋白与候选抑制剂复合物三维结构解析及作用模式分析
一、选题背景：
p97蛋白也称为vcp (valosin-containing protein)，p97蛋白是一种六聚体AAA 腺苷三磷酸酶，可以将ATP水解释放的化学能转变为机械能，进而参加细胞内的多项生理活动，包括内质网相关降解、线粒体相关降解、染色体相关降解等，因此p97蛋白在维持细胞内环境稳态中发挥着重要作用。p97蛋白在正常生理状态下为六聚体，每个单体包括一个N端、D1以及D2结构域，每个结构域在生理过程中发挥不同的作用。现已发现许多神经退行性疾病与p97蛋白的突变有关；并且在许多癌症中观察到野生型p97蛋白有过量表达的现象。现已发现p97蛋白中D2结构域有大的ATP酶活性。由于p97蛋白有非常强大的生理作用，以p97为靶点研制药物有望成为治疗神经退行性变、癌症等疾病的新思路。目前已有报道称p97抑制剂与其他药物联合使用可以使其它药物的癌细胞毒性大幅提升。
随着第一个p97抑制剂进入临床，其小分子抑制剂也得到了一定的重视，因此p97小分子抑制剂的开发与应用有十分重大的意义。在此基础上，本课题准备利用异源表达技术在菌体内表达产生p97蛋白特定片段，再通过蛋白纯化技术获取足量的p97蛋白短截体并将纯化获得的p97短截体与候选小分子抑制剂形成复合物。并对确定的p97截短体蛋白/抑制剂复合物进行结晶条件筛选、优化获得符合X-射线衍射标准的蛋白晶体，解析结构，通过抑制剂与蛋白结合模式的分析阐明作用机制。
二、研究方法：
1：p97短截体构建
⑴：短截体编码基因片段的获取：由指导教师提供p97蛋白短截体编码基因片段，并对目的基因利用PCR技术进行扩增后使用琼脂糖凝胶电泳技术对克隆片段验证、纯化、保存、使用。此步骤中需在插入片段正/反向PCR引物5rsquo;端引入下一步骤中线性化载体的末端序列，使得PCR产物5rsquo;和3rsquo;最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列(15 bp - 20 bp)。
⑵：重组质粒的构建：①：载体线性化：将载体质粒用预先设计的两种DNA内切酶酶切，使其产生与目的基因末端序列互补的基因序列，由于常用载体基因序列已知，因此可以推算成功切割的线性化载体的长度。将酶切后的线性化载体使用琼脂糖凝胶电泳技术进行电泳，回收正确长度的酶切产物，即可获得合适的线性化载体。②构建反应体系使目的基因与线性化载体连接构成重组质粒，因为粘性末端序列不同因此发生错误重组的概率很低。
⑶：重组质粒的扩增：利用特定细胞对重组质粒进行扩增，步骤如下: ①将重组质粒导入感受态大肠杆菌细胞（实验室用大肠杆菌，可以使外源质粒在细胞内大量扩增且无其他质粒的干扰） ②将转化的大肠杆菌进行筛选培养，因为质粒和目的基因片段上分别带有不同抗生素的抗性标签，所以可以利用在无菌培养基中同时加入抗性标签对应的两种抗生素的方法筛选成功转化的大肠杆菌（未成功转化的大肠杆菌会因为没有对应的抗性而被抑制、杀死）。 ③：将培养至合适程度的大肠杆菌离心收集菌体，利用相应试剂盒进行提质粒处理，检测浓度后保存待用。
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