开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 研究背景、目的及意义
自1982年FDA批准第一个治疗性重组药物——胰岛素最开始，重组蛋白药物得到了快速发展，在生物医学领域得到了广泛应用，包括癌症治疗、疫苗开发和疾病诊断等[1]。蛋白质药物的广泛应用一方面是由于蛋白质药物作用方式非常广泛，从调节机体各系统的细胞生长，扩展到被动免疫、替代疗法和抗凝血等。另一方面是与传统的小分子药物相比，蛋白质可以快速、特异、瞬时的调控细胞的生物学功能，并且具有较小的毒副作用[2]。但是由于蛋白质分子量高、尺寸较大、具有亲水性，不能自发透过细胞膜，所以目前上市的所有蛋白质药物都是基于胞外靶点开发的[3]。据估计，超过70%的基因编码蛋白位于细胞内，而由于这一限制，这些蛋白质都属于蛋白疗法中的无成药性靶点[4]。因此为了使蛋白质药物能够得到更加广泛的应用，开发更加有效的跨膜递送系统就显得尤为重要。
目前，为了将蛋白递送到细胞内，研究人员已经尝试开发了多种策略，主要可分为两类。第一类是非载体递送，即用一些化学修饰、物理方法对细胞膜进行干扰，从而改变膜的通透性[5]。例如一种基于正电荷聚合物的蛋白递送系统，该系统通过跨聚合物二硫键自组装带负电荷的蛋白质[6]，能够使蛋白在胞内释放，但非载体的方法可能导致细胞损伤或产生细胞毒性。另一类是运用载体，目前常用的载体有病毒、脂质体、高分子聚合物等，但此类递送策略大多不具有普适性，且血清耐受性低，内涵体逃逸效率不高[7]。因此开发一个新型的能够高效递送药物且具有内涵体逃逸性质的递送系统，对靶向胞内生物分子的蛋白质药物的发展非常重要。本课题组在前期研究中构建了一种含40个氨基酸残基的超电荷聚多肽递送系统，并得到了超电荷聚多肽与GFP融合蛋白，该融合蛋白能够高效的被细胞摄取并从内体逃逸，进入到活细胞的细胞质。除此之外聚多肽还具有生物可降解性，没有肾脏堆积的风险，没有毒性的代谢过程、可通过发酵大规模生产等优势[8]。基于此，我们期望利用多肽合成技术得到含有40个氨基酸残基的、FITC标记的超电荷聚多肽，利用荧光显微镜、流式细胞术、激光共聚焦等研究单独的超电荷聚多肽的细胞摄取效率及其细胞摄取机制，为后续的研究打下基础。
二、课题研究的主要内容
1. 超电荷聚多肽与GFP融合蛋白的细胞摄取效率研究
1.1 细胞复苏及细胞培养：主要包括HeLa细胞、PC12细胞、Jurkat细胞等。
1.2 细胞摄取效率研究：超电荷聚多肽与不同细胞进行孵育后，荧光显微镜及流式细胞术分析不同细胞对超电荷聚多肽的摄取效率。
2. 超电荷聚多肽的胞内定位研究
2.1细胞培养：不同细胞株与超电荷聚多肽在37℃，5% CO2培养箱孵育不同时间。
2.2胞内定位检测：用含肝素（20 U/mL）的PBS洗涤，洗去细胞膜表面结合的蛋白，通过荧光显微镜及激光共聚焦显微镜等观察分析超电荷聚多肽的胞内定位情况。
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