开题报告内容：
1、拟研究的问题：研究表达WB-S101的毕赤酵母的发酵条件，对其进行摇瓶水平的发酵工艺优化。
2、研究内容：对于生物药物产业来说，微生物发酵是不可避免的急需攻破的关键技术。首先需要对摇瓶小试发酵优化，进而初步确定发酵参数，为发酵罐进一步优化提供基础。首先需要进行小试摇瓶发酵优化，主要有接种量、温度、摇床转速、诱导时间、诱导方法等等，通过一系列的单因素实验初步确定发酵工艺参数，之后进行放大试验验证小试优化结果，再对高密度发酵进行优化，包括培养基成分、溶氧浓度以及补料方式等。
3、研究手段：
首先进行单因素试验对若干个因素如温度、接种量等进行优化，主要是通过对菌体的生长曲线对该因素进行分析，从而得到初期的发酵条件。微生物受温度的影响范围十分广泛，温度改变会导致微生物内许多酶发生变化从而使其生化反应发生变化。低温条件会让微生物的生长代谢速度变缓或停止，但不至于使微生物死亡，但如果温度过高就会让微生物体内的许多酶失活，从而死亡。接种量对菌体生长发育也存在一定的影响，一般情况下，接种量越大，菌体生长到达稳定期的时间会缩短。但接种量也不宜过大，一旦接种量过大会使摇瓶内养分和溶氧不足，使菌体无法生长，同时接种量过低，不利于后期的诱导表达，菌体浓度不够，无法得到较高浓度的目的蛋白。通过实验得到的菌体生长曲线以确定所用酵母工程菌的发酵初期的最佳培养温度和接种量。
之后再对发酵时的其他参数进行优化，比如说培养基的pH值、诱导温度、诱导时机等等。这一部分的发酵条件优化需要通过SDS聚丙烯凝胶电泳对发酵液进行分析，通过电泳条带的深浅和颜色来判断表达产物的量，从而对发酵的各种条件进行选择从而达到优化的目的。pH作为发酵过程中重要的化学参数，对发酵液的物理性质、细胞膜的电荷状态及参与细胞反应的酶活性等有重要影响，进而影响菌体的生长及目的蛋白质的表达。温度则可以作为诱导工程菌表达目的基因的一种手段，温度不仅会影响菌体的生长等间接影响到目的蛋白的表达，也可以作为基因调控的一种手段直接操控目的基因的表达。经过一系列实验之后，需要对实验数据进行分析，从而得到具有一定参考价值的发酵工艺参数，之后可能需要进行一定的放大实验进行验证。
4、主要成果形式：达到符合并且有利于商业扩大化生产的要求的表达WB-S101的毕赤酵母工程菌摇瓶小试发酵工艺参数，达到一定WB-S101产量的中等规模的高密度发酵工艺条件。
5、文献综述：巴斯德毕赤氏酵母（Pichia pastoris）作为一种高效、稳定的外源蛋白表达系统，具有操作简易、遗传稳定性高、胞外蛋白表达量相对较高等优点，在外源基因表达领域得到了广泛的应用。
而对于重组的工程菌而言，重要的问题在于得到一定量的外源蛋白，才能达到基因重组的目的。而影响不同外源蛋白在毕赤酵母中表达的因素一方面来自于细胞水平的工程菌构建，即通过基因操作手段提高单个细胞的蛋白分泌量；另一方面，从宏观角度上通过优化发酵工艺来提高外源蛋白的表达量。根据已有的重组工程菌，则需要对发酵工艺进行优化，首先从摇瓶水平进行优化，再逐级进行放大。
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